是否完全应该用同型对照来划出阳性群

特勒兮兮 · 发表于 2017-3-13 15:56:21

同型对照---均加1uISOl抗体
ISO 1ul.png

实验样本---CD3和CD56 均加1ul
CD3及CD56各1ul.png

同型对照---均加2ulISO抗体
ISO 2ul.png

实验样本---CD3和CD56 均加2ul
CD3和CD56 各2ul.png

同型对照---均加4ulISO抗体
ISO 4ul.png

实验样本---CD3和CD56 均加4ul
CD3和CD56各4ul.png

上面是我培养的细胞然后测了一下细胞表型，要得出CD3和CD56 双阳性比例，习惯上用同型对照来分出阳性细胞群，但是做了一个实验，随着抗体的量的增多，同型对照坐标框的Y坐标值也增高，若再用此分界线分出阳性细胞群，阳性率明显降低，例如最后两张图（加抗体4ul），ISO的y坐标明显高于加1ul抗体的Y轴坐标，所得出的双阳性的比例也降低，按道理来说随着抗体量的增加，阳性率要么不变，要么升高①请问这是什么原因？②还有如何更加好的方法得出双阳性的比例，求站内各位大神指导

niwanmao · 发表于 2017-3-13 19:38:12

其实CD3和CD56的分群都挺好，所以你要测双阳性的NKT不用同型对照也能正确划分出。
如果真担心画不好，试试密度图。

特勒兮兮 · 发表于 2017-3-14 11:49:34

niwanmao 发表于 2017-3-13 19:38
其实CD3和CD56的分群都挺好，所以你要测双阳性的NKT不用同型对照也能正确划分出。
如果真担心画不好，试试 ...

第一：我是想问为什么ISO 抗体加多了，它的Y轴会上移。
第二：双阳的分群是很清楚，但是为什么抗体增量了之后（最后两幅图）他的阳性率反而降低了，不管按不按同型对照划分，都是降低了

niwanmao · 发表于 2017-3-14 13:47:37

特勒兮兮发表于 2017-3-14 11:49
第一：我是想问为什么ISO 抗体加多了，它的Y轴会上移。
第二：双阳的分群是很清楚，但是为什么抗体增量了 ...

1、同型抗体也是抗体，所以也存在非特异性结合，这种非特异性结合现象和抗体浓度相关，跟滴定一个道理。
2、并不是比例降低，而是门画的不对，所以我一直认为同型不是画门的理想参照，而应该是生物学阴性对照是最好的参照。前两个浓度，分群都还是不错的，门应该再往上一点。最后一个4ul的时候，分群反而不清了，说明这个浓度是过量的。

闷油瓶 · 发表于 2021-5-22 21:19:15

niwanmao 发表于 2017-3-14 13:47
1、同型抗体也是抗体，所以也存在非特异性结合，这种非特异性结合现象和抗体浓度相关，跟滴定一个道理。
...

老师，您从哪里看出来他的细胞分群了？我怎么感觉三幅图都是一样的呀

niwanmao · 发表于 2021-5-23 10:39:09

闷油瓶发表于 2021-5-22 21:19
老师，您从哪里看出来他的细胞分群了？我怎么感觉三幅图都是一样的呀

相对而言。你都能看出来说明已经有比较丰富的经验了[点赞]

2315471758 · 发表于 2022-10-10 17:12:26

4ul的时候ISO的CD56门都往上一点了，可能是浓度高了，导致检测管的CD56门跟着上移，降低了CD56+

范晋波 · 发表于 2022-10-13 09:50:59

特勒兮兮发表于 2017-3-14 11:49
第一：我是想问为什么ISO 抗体加多了，它的Y轴会上移。
第二：双阳的分群是很清楚，但是为什么抗体增量了 ...

其实两个问题是一个原因，就是抗体的背景干扰，抗体越浓，阴性群体的荧光越强，但是阳性处于饱和状态，并不是说抗体加的越多阳性越强，阳性的强弱与Maker位点的多少是直接关系

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