生发中心B

wsgcc

各位老师：前两天进行流式细胞检测生发中心的B细胞，使用的抗体如下表，同型对照组用的是上面两种抗体的同型对照+抗B220的抗体。在分析结果时出现问题，如图1是同型对照，基本正常；图二是样本；图三是在图二的基础上加了轴出现的结果；图4是标记的那两个轴。现在双阴性细胞在负值的位置，不知为何？恳请大家指教，谢谢！

FITC-labeled anti-GL7

PE-labeled anti-FAS（CD95）

PerCP-Cy5.5-labeled anti-B220 mAb

niwanmao

看不到你的FSC/SSC散点图，感觉这些细胞应该是非特异性染色居多，最高都跑到外面去了。

wsgcc

第一张图是另外一天（4月14日）做的，电压、补偿、操作完全相同，电压是按照空白细胞调的，4月11日同型对照的双阴位置是正确的，但同一天样本的就不正常，如图2，在轴前打上勾就成了图3的样子，所以很让人费解。

niwanmao

wsgcc 发表于 2017-4-27 15:11
第一张图是另外一天（4月14日）做的，电压、补偿、操作完全相同，电压是按照空白细胞调的，4月11日同型对照 ...

从图上看，应该是存在过高的非特异性染色，导致阳性信号跑到外面去，这种染色最大的可能性就是死细胞或状态不好的细胞造成，可考虑加上7-AAD或PI等核酸染料，排除掉死细胞，就可避免或减少。

至于勾选Biexp之后，下面阴性细胞群出现一大堆，这是正常的，因为双指数的目的就是把负值信号显示出来。

wsgcc

那为什么同型管的双阴细胞基本都是正值呢？那天的样本同时做了另外一个Tfh 细胞四色的流式检测都没有问题。

niwanmao

wsgcc 发表于 2017-4-28 18:49
那为什么同型管的双阴细胞基本都是正值呢？那天的样本同时做了另外一个Tfh 细胞四色的流式检测都没有问题。 ...

那个图怎么样的？
一般除非两管之间有同样的抗体才有可比性。

wsgcc

图1是当天同型对照的，图2是当天的Tfh检测的，都没有问题。细胞的处理完全相同。

niwanmao

wsgcc 发表于 2017-5-1 11:56
图1是当天同型对照的，图2是当天的Tfh检测的，都没有问题。细胞的处理完全相同。 ...

按照你目前的反馈来看，我个人感觉还是抗体非特异性结合水平和用量这两个问题可能性比较大。

我的建议是这样：
1、用BiExp可以使阴性群显示出来，目前的分析可以照此分析。
2、下次再做，建议事先进行FAS抗体的滴定，寻找最佳用量，并且增加一个可靠的生物学阴性对照。
3、如果无论怎么调节还是如此，建议联系厂家。

wsgcc

感谢您的分析。同样的细胞处理和抗体用量，另一天的样本毫无问题。所以很疑惑。因为这个检测已经做过多次，一直是按照这个抗体用量做的没有问题。只有这一天出现了这种情况。

niwanmao

wsgcc 发表于 2017-5-2 09:26
感谢您的分析。同样的细胞处理和抗体用量，另一天的样本毫无问题。所以很疑惑。因为这个检测已经做过多次， ...

你的意思是同类标本，用FAS抗体在另一天不是这样的图形？那得注意一下液路问题了，可能是这管样本上的时候是不是由于流式细胞仪液路异常造成信号异常。看一下Time参数图。