同型对照的操作

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关于同型对照的问想向大家请教一下：我做的是人调节性T细胞：CD4+CD25+Foxp3.购买了BD的抗体及同型对照抗体如下：
1、 PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD4及PerCP-Cy™5.5 Mouse IgG1 κ Isotype Control
2、 PE Mouse Anti-Human CD25及 PE Mouse IgG1, κ Isotype Control
3、 Alexa Fluor® 647 Mouse anti-Human FoxP3及Alexa Fluor® 647 Mouse IgG1 κ Isotype Control

实验的时候我做了三管：空白管、同型对照组（加了CD4、CD25和Foxp3的同型对照抗体，步骤跟实验管一模一样只是实验管加的抗体）以及实验组（加CD4、CD25和Foxp3三种抗体）。重复做了两轮，做出来的同型对照和实验管的结果是一样的。不知是不是抗体未染上，另外一个是我对于同型对照不是很理解，想请教您一下，我这么做的同型对照是否正确？

niwanmao

做一个实验，抓住关键点后重要。
你要测的是调节T细胞，所以关键是圈出调节T细胞，而正常情况下，CD4分群很好，但是需要加一个CD3来帮助排除掉单核细胞，CD25分群也还可以 ，foxP3分群也不错。所以你这个实验根本不需要同型对照。你可以搜索一下站内资料（关键词 ：同型对照），同型对照一般是不建议使用的。

建议增加一个CD3 FITC，以便更好的圈出淋巴细胞，排除掉单核细胞CD4的干扰。
其次，如果做不出结果，需要从破膜剂的效果、foxP3抗体的质量等方面去逐一排查。

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niwanmao 发表于 2017-7-19 10:27
做一个实验，抓住关键点后重要。
你要测的是调节T细胞，所以关键是圈出调节T细胞，而正常情况下，CD4分群很 ...

增加CD3 FITC，那是要跟CD4、CD25一起做表染吗？我预实验有双染的对照，应该是能排除破膜的好坏吧？

还有，组织保存在负八十度一年以上的还能做调节性T细胞吗？

niwanmao

1060990080 发表于 2017-7-19 11:10
增加CD3 FITC，那是要跟CD4、CD25一起做表染吗？我预实验有双染的对照，应该是能排除破膜的好坏吧？

还 ...

1、CD3、CD4、CD25均为表面。
2、双染的对照是什么意思？如果foxP3有明显的分群，才说明抗体和破膜剂都是好的。
3、组织保存－80度一年以上，即使是DNA也降解的差不多了，更不用说细胞。不建议用。

1060990080

niwanmao 发表于 2017-7-19 11:20
1、CD3、CD4、CD25均为表面。
2、双染的对照是什么意思？如果foxP3有明显的分群，才说明抗体和破膜剂都是 ...

倪老师，我阔以把预实验数据打包了麻烦你分析一下吗？

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我是新手，帮我上流式那位老师也是新手，真的需要求助~~

niwanmao

1060990080 发表于 2017-7-19 11:24
倪老师，我阔以把预实验数据打包了麻烦你分析一下吗？

将图传到这里即可。

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压缩包有图以及实验流程说明，麻烦倪老师了

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倪老师，压缩包的图你看了么？