如何进行Fc-blocking？

fitlao

胞内染色Fc-blocking需要染表面和染胞内前做2次吗？还是只需要染表面时做，或是染胞内时只做一次？每次封闭后需要等待反应后清洗后再染色，还是封闭后可以直接染色？看到不同文章有不同的做法，还是完全根据所用Fc-blocking的试剂说明操作？望各位高手指点，谢谢！

niwanmao

fitlao 发表于 2017-9-19 01:17
这是miltenyi的说明书，操作挺简单的。但胞内也可以这么操作吗？需要表面、胞内各封一次吗？ ...

因为要阻断的就是细胞表面的Fc受体，所以跟做表面还是胞内标记无关，只需要事先加Fc Blocking孵育5分钟，然后直接加抗体即可。

fitlao

这是miltenyi的说明书，操作挺简单的。但胞内也可以这么操作吗？需要表面、胞内各封一次吗？

fitlao

非常感谢@niwanmao 老师，每次非常及时、专业的回复！
我们关注的是细胞内某个因子或受体的表达。这样的话做表面受体封闭是否有意义？是否必须做同型对照？
还是说无论表面还是胞内，可能影响结果的主要是荧光抗体与细胞表面受体的非特异性结合。所以阻断了细胞表面的Fc受体后，检测胞内受体或细胞因子，也不需要再做同型对照？

niwanmao

fitlao 发表于 2017-9-20 00:04
非常感谢@niwanmao 老师，每次非常及时、专业的回复！
我们关注的是细胞内某个因子或受体的表达。这样的话 ...

你检测胞内某个受体或因子，肯定需要同时做表面标记以区分细胞亚群，如果要标表面标记，并且这几个表面标记分群不一定好的话，还是建议做一下Block，不是为了受体或因子，而是为了表面标记。

如果你觉得不需要使用表面标记设门，那么不做也可以。

我不知道你是几色方案，如何搭配，所以对照的设置无法给你具体的说明，但至少生物学阴性对照是最好的。同型对照不是很推荐，只有在实在找不到生物学阴性对照的情况下勉强、谨慎使用。