同时应用直标和间标的孵育条件

minazeng

之前我用4度孵育间标一抗完全做不出来。后来幸运看到一些见解后更改方案：间标一抗，室温，30min；间标二抗，4度，30min；直标，4度，30min。结果可以染上倒数第二圈门内细胞，但是最后一个圈门(目的细胞)染色阳性率仍非常低，大概3%，还是远低于文献19%。我准备尝试用浓度滴定和尝试不同孵育时间（30min和45min）优化，因此我想请教大神们几个问题：

（1）影响细胞的阳性率主要因素是孵育时间和温度对吗？感觉在论坛上看到关于浓度滴定的讨论，浓度主要影响信噪比，但不会对阳性率有明显的影响（如3%和19%的区别）？

（2）除了间标，我还同时染了直标抗体。由于之前实验只染直标（4度/30 min）时效果很好，而且，已比对单独染直标和同时染间标、直标时，直标的阳性率没有显著差异。所以现在同时染是否可以采取间标的两个抗体室温孵育，直标继续沿用4度孵育？

（3）设计实验时因为考虑到是多色荧光（5色），而且采血后马上处理新鲜外周血标本，没有任何干预，所以没有同时做活细胞染色。但由于protocol 是要求4度孵育的，室温孵育是否必须同时做活细胞染料？否则是否以后文章会被拒收？

niwanmao

1、影响阳性率的主要因素当然是细胞本身喽：）  只要抗体质量过关，并且细胞确实表达比较高水平的抗原，那么孵育时间和温度都不会是大问题，我怀疑你要检测的抗原本身就是不分群，只是存在峰的偏移，那样的话，一点点偏移都会造成很大的数值改变，此时，FcBlocking+一抗+二抗同型就比较重要了。

2、相对来说，只要抗体质量没问题，直标会更可靠一些，4度和室温不是问题所在。

3、没听说过这个原则，室温要用活细胞染料，4度就不需要。一般说来，从要求上说，活细胞染料无论什么条件都是需要用的。

minazeng

niwanmao 发表于 2017-11-4 09:34
1、影响阳性率的主要因素当然是细胞本身喽：）  只要抗体质量过关，并且细胞确实表达比较高水平的抗原，那 ...

谢谢倪老师，我再调整一下染色方案尝试。