荧光补偿的问题

steven

各位老师大家好，今天又有一个问题咨询大家。

这次要做一个双染色的流式检测，有一些问题想请教大家。
试剂打算买 anti-CD44-FITC，anti-CD24-PE的荧光素偶联抗体和两者对应的Isotype抗体。

现在想做的是确认目标细胞是CD44和CD24双阴性，所以问题来了，样本中几乎没有阳性的细胞，在调节补偿的时候该怎么办啊。CD44-FITC和CD-PE两个单染样品估计都没有什么荧光，根本没法用来调节补偿啊。

还有一个问题，这次买了Isotype抗体，画十字门的时候是不是就可以不用没有染色的阴性对照了？是不是应该用Isotype-PE和Isotype-FITC双染的样品来确定位置啊？
原来都是做单一染色，初次涉及双色，还请大家帮我解答一下。

niwanmao

steven 发表于 2017-11-29 12:34
谢谢倪老师。

我第一个问题可能没太说明白，我的意思是当CD44低表达的时候，可以通过一个替代品（比如CD ...

前面的意思就是让你用CD8 FITC替代CD44 FITC，你可能没理解。
直标抗体对应直标抗体，不能用间标代替。

niwanmao

1、同型对照应该放弃，站内很多帖子都讨论过，请搜索“同型对照”。正如你自己所说，样本中几乎没有阳性细胞，因此，设门参照就很容易定。
2、补偿调节两个方法：1、用同种细胞阳性表达高的标记来调节，例如你的样本是淋巴细胞，可选择CD4 FITC和CD8 PE来调节补偿，这个补偿值可以用于CD44 FITC和CD24 PE的。 2、购买补偿微球，补偿微球代替细胞进行调节，但该补偿值可能与真实补偿值略有差异。

steven

niwanmao 发表于 2017-11-26 17:33
1、同型对照应该放弃，站内很多帖子都讨论过，请搜索“同型对照”。正如你自己所说，样本中几乎没有阳性细 ...

谢谢倪老师。
就是说在目标抗原低表达的时候，可以选择一个高表达的目标+荧光素的组合来进行荧光补偿调节对吧。
还有一个问题，比如说我用的抗体是偶联抗体CD44-FITC，做补偿的时候（比如说用CD4 FITC）也一定要选一个高表达的偶联抗体，还是说也可以用第一抗体+第二抗体的选择做补偿（比如说mouse anti-CD44和anti-mouse-FITC）？
最后一个问题，因为我用的这个细胞估计几乎全阴性，不做补偿直接测可不可以啊？会有假阳性的可能出现吗，比如说因为没调节补偿，阴性细胞的自发荧光出现在FITC或PE通道的情况造成假阳性。
谢谢。

niwanmao

steven 发表于 2017-11-27 10:58
谢谢倪老师。
就是说在目标抗原低表达的时候，可以选择一个高表达的目标+荧光素的组合来进行荧光补偿调节 ...

1、你即使用间标标记CD44，它依然是低表达的，还是不能用来做补偿单染调节呀。
2、自发荧光会有，但应该是可以通过排除死细胞、碎片等方式尽量避免掉。

steven

niwanmao 发表于 2017-11-28 07:58
1、你即使用间标标记CD44，它依然是低表达的，还是不能用来做补偿单染调节呀。
2、自发荧光会有，但应该 ...

谢谢倪老师。

我第一个问题可能没太说明白，我的意思是当CD44低表达的时候，可以通过一个替代品（比如CD8-FITC）来进行荧光补偿调节。如果CD44用的是CD44-FITC偶联抗体的话，做荧光补偿用的CD8抗体也必须是偶联抗体吗？还是说也可以采用CD8一抗+FITC二抗的方式。

steven

niwanmao 发表于 2017-11-29 14:03
前面的意思就是让你用CD8 FITC替代CD44 FITC，你可能没理解。
直标抗体对应直标抗体，不能用间标代替。 ...

谢谢倪老师。

我明白了，低表达时可以用高表达的替代做补偿，并且抗体单双标要选择一致的。