关于荧光补偿，溢漏的问题

iamkugua

有个问题，请教一下这里的大神。我看到我们机器的configuration，十二色的有点晕。说是上面的12色都可以同时用，但是我看到不同激光器激发的发射通道有些激发光是重合的，比如,405-B和640-C？405-C和488-B？这个怎么直接看出没有溢漏？难道是不同的激光器，激光打到细胞上的时间长短造成，即使一样的发射通道也可以同时用？不懂。。。求解！谢谢啦。

configuration

niwanmao

三根激光，光路分布不同，这12个通道可以同时测的。

chevalierx

论坛里之前有过前辈有比较详细的解释，稍微搬运下：可以理解为是细胞分别依次通过3根在物理上有间隔的激光束，每个激光束分别配备独立的几套滤光片和接收器，因此在理论上，不同激发光，相同发射光的信号在物理上是相互独立的。但实际上，以我目前用的fortessa为例（4激光18色，405,488,561,640），在部分发射光重叠较多的荧光之间，仍会存在较高的溢漏，用足通道数只是一个理论上的理想值，建议LZ在配荧光的时候，还是本着能不重叠就别重叠的精神来操作。

iamkugua

niwanmao 发表于 2017-12-27 18:59
三根激光，光路分布不同，这12个通道可以同时测的。

倪老师，您好。这三根激光器是因为物理空间上的分布不同，然后及时相同发射光也可以使用？并且有些不同激光器虽然荧光通道发射光谱很近但overlap还比较小，为什么？物理隔阂？还是时间差？
在配色是主要考虑荧光(或者抗原）强弱就可以？不需要考虑发射光谱的重叠？

niwanmao

iamkugua 发表于 2017-12-28 09:00
倪老师，您好。这三根激光器是因为物理空间上的分布不同，然后及时相同发射光也可以使用？并且有些不同激 ...

发射光的补偿要考虑的，而且还要考虑你要检测的靶抗原表达量。
你这台机器12色，我这边这台10色，大部分都一样，就是紫光BV系列多2个通道。我平时这10色都是用全的。

Jeff

三个激光，激发荧光后，进入不同的分析系统，所以就算滤光片是一样的，也没有关系。这就是，平时为什么很多人说，不同激光下的染料，基本上是不需要调补偿的

iamkugua

Jeff 发表于 2017-12-28 16:32
三个激光，激发荧光后，进入不同的分析系统，所以就算滤光片是一样的，也没有关系。这就是，平时为什么很多 ...

谢谢答复。还有你说的这个不同激光器下的荧光不用调补偿。。。我就想了解为啥？怎么直接看出来有没有overlap？从光谱图上面？还是就是经验的累积。。。

Jeff

iamkugua 发表于 2017-12-29 14:35
谢谢答复。还有你说的这个不同激光器下的荧光不用调补偿。。。我就想了解为啥？怎么直接看出来有没有over ...

真正来说，应该是：不同激光下的染料，不会有太大的补偿，因为，每一种染料的激发波长都有一定的范围（只不过激发的效率不一样而已），所以，就算不同激光系统下，也有可能是需要稍微进行下补偿调节的。目前像BD的流式细胞仪，不同激光激发的染料，对应的光学分析系统都是独立的。因此，理论上，不同激光激发的染料间，是不需要补偿调节的。但，建议还是每个染料对其他通道都看一下（反正也花不了什么时间）

iamkugua

Jeff 发表于 2018-1-2 16:51
真正来说，应该是：不同激光下的染料，不会有太大的补偿，因为，每一种染料的激发波长都有一定的范围（只 ...