流式分选组织单个核细胞

STRIVING

分选脑组织单个核细胞，取37%percoll与70%之间的细胞层，但是中间层不明显，取了之后离心之后，也没有看到细胞沉淀，求有没有大神做过，求指教，谢谢！

whyxa

不知道你是什么动物的，小鼠的？我做过猴子的，组织匀桨后，过滤掉组织块，离心沉淀重悬成30%的SIP（SIP=90%的percoll），这个30%的SIP要用粉色的HBSS配置，下层是70%的SIP 用无色的HBSS配置，percoll的时候尽可能的稀一些，大多组织里含有蛋白，很容易有凝块。洗液里加一些0.05%EDTA，即使看不到白膜层，一样步骤取细胞，其实拿不到多少细胞的，除非病变特别严重也不一定有很多细胞拿到。看不到细胞沉淀也无所谓，可以数到细胞就好，拿的细胞别过夜，直接用掉吧，死的很快，直接染色还好，刺激培养就没多少细胞了。 我们的实验还没发表，方法只能告诉你这么多了。

whyxa

我们也一直在摸索方法，效果也不是很好，偶尔能拿到好一点的细胞也就几个million，后来取脑细胞太麻烦就放弃了，改做其他组织了。

STRIVING

whyxa 发表于 2018-1-20 02:20
不知道你是什么动物的，小鼠的？我做过猴子的，组织匀桨后，过滤掉组织块，离心沉淀重悬成30%的SIP（SIP=90 ...

太感谢了，我取得是C57小鼠，目前取出来的检测是有细胞的，但是我要做分选，老师说细胞数太少，不分选，我目前已经取到6个半脑的量了，细胞还是很少

STRIVING

whyxa 发表于 2018-1-20 02:20
不知道你是什么动物的，小鼠的？我做过猴子的，组织匀桨后，过滤掉组织块，离心沉淀重悬成30%的SIP（SIP=90 ...

始终中间的白膜层不明显，请问还有什么好的建议吗？谢谢

niwanmao

STRIVING 发表于 2018-1-27 20:35
始终中间的白膜层不明显，请问还有什么好的建议吗？谢谢

有个帖子，专门讨论PBMC的提取，可搜索一下。

油菜花快点儿跑

我用的40%-70%percoll提取中间层的，提几点我曾经犯过的错误
1，percoll原液要先配置成100%percoll（10 X PBS 1:9稀释），再用1x PBS 配置梯度的percoll
2，离心一定要用水平离心机，梯度升降转速 我的是2400rpm/30min 4摄氏度
3，取中间层时候要对准光源，能看到折射界面，取到后面云雾层细胞取完了，界面会越来越清晰的。
4，取出的细胞要加入适量的PBS 轻轻混匀后再离心，清洗掉percoll，在percoll里是离心不下来细胞沉淀的。