在10多次的洗涤后，怎样保留更多的淋巴细胞

luyexianzong

从外周血分离淋巴细胞后经以下步骤处理上机检测。
1. Fc 封闭后，洗涤3次，
2.Live/Dead 染色后，洗涤2次，
3.表面抗原染色后，洗涤3次，
4.固定/透膜，洗涤2次，
5.胞内抗原染色，洗涤2次。

以在EP管、96孔板和48孔板均操作过。
在Fc封闭前，细胞计数均在2x10^6以上，但是待这些处理完之后，细胞数量已经少的可怜。
EP管内处理的略好，但是细胞板中处理的细胞数目非常少？

EP管处理慢，细胞板处理快。
请问大家有没有好的办法？
调整合并步骤，或者有小的技巧，欢迎赐教。
感激！

chevalierx

首先我觉得你既然是胞内染色要固定破膜的，肯定都是死细胞，那死活染料那一步就可以直接去掉了，另外封闭Fc，表面抗原的洗涤都可以缩减到1次，最后胞内染色以后可以洗2-3次。。。我一般偷懒的时候封闭完Fc端不洗直接染表面抗原的。。。洗太多次如果操作不好很多稀有亚群估计都检测不到了

ghqiu09

96孔板可以用U型或者V型的。两百万个细胞其实并不多，可以多加一点

luyexianzong

ghqiu09 发表于 2018-2-11 08:38
96孔板可以用U型或者V型的。两百万个细胞其实并不多，可以多加一点

多谢！原始细胞数，没法提高太多。由于外周血的采血量受限制了，最多0.5ml.

luyexianzong

chevalierx 发表于 2018-2-10 18:20
首先我觉得你既然是胞内染色要固定破膜的，肯定都是死细胞，那死活染料那一步就可以直接去掉了，另外封闭Fc ...

谢谢！正在考虑根据最终的检测目的，减少一些步骤。非常感谢！

niwanmao

都可以只洗一次的，但是建议在流式管，大体积洗涤。

niwanmao

luyexianzong 发表于 2018-2-11 08:46
谢谢！正在考虑根据最终的检测目的，减少一些步骤。非常感谢！

洗涤只需要PBS即可，1ml不够，至少需要2ml甚至更多，成本怎么会高呢？BSA可加可不加。