小鼠血液样品分析

VortexDou

大家好，我最近用小鼠血液样品做了一次流式，结果我发现居然有35%-40%的CD3阳性细胞，小鼠是健康的野生型，正常情况下血液中应该只有17-20%才对。
设门时我用了FSC-A FSC-H 和SSC-A SSC-W圈出单个细胞，再用CD45, Live/dead染料圈出活细胞，然后直接看CD3 CD11b的散点图。
我制备流式样品的方案如下：
1.取EDTA包被样品管中200ul血液，采用ebioscience的10X红细胞裂解液(用MiliQ水稀释至1X)，加2ml后室温避光孵育8分钟，PBS加至10ml洗两次，再用FACS buffer(PBS+2% FBS+ 2mM EDTA)洗一次后重悬在有Fc block(1:100)的 FACS buffer中孵育至少10分钟。
2.加入相应抗体(Live/dead dye, Ly6c, Ly6G, CD3, CD45, CD45R, CD11b, CD11c)，1:100 4度避光孵育30-45分钟，洗去未结合抗体上流式。

因为不确定是自己数据分析上的问题还是自己实验步骤出了问题所以把两部分都贴上来了，烦请各位老师指点，谢谢！

tiger

两次去粘连，去掉了粒细胞和大部分的单核细胞。所以淋巴细胞比例就高了。

niwanmao

每个通道对应的标记分别是？

VortexDou

niwanmao 发表于 2018-12-18 10:06
每个通道对应的标记分别是？

老师您好，这里的BV510是死活细胞染色，阴性为活细胞，PI为CD11b,BV421为CD3标记

tiger

第一步去粘连，舍弃了大部分的粒细胞，第二步又舍弃了大部分的单核细胞。所以CD3的比例就增高了。测试的没问题，只是设门有问题，调整一下去粘连策略就可以了。

VortexDou

tiger 发表于 2018-12-19 11:43
第一步去粘连，舍弃了大部分的粒细胞，第二步又舍弃了大部分的单核细胞。所以CD3的比例就增高了。测试的没 ...

谢谢解答，我再重新分析下我的样品，请问可以不做去黏连的第二步吗？

tiger

VortexDou 发表于 2018-12-19 19:29
谢谢解答，我再重新分析下我的样品，请问可以不做去黏连的第二步吗？

把数据传上来。