再问：多聚甲醛对流式抗体标记的影响

水蜻蜓

倪老师您好：

    看到你有关“多聚甲醛对流式抗体标记的影响”的答复，我现在有个问题，就是我做血小板，染色后用1%的多聚甲醛固定2h后检测 和染色后加1ml PBS 直接上机 有很大差别，染色后固定上机CD61 为60%多 ，CD62P 为18%左右，且 CD61阴阳性分不开，而染色后加1ml PBS 直接上机CD61 为80%多 ，CD62P 为11%左右，不知道为什么会这样呢？我看书上说染色后用1%的多聚甲醛固定可以在24h内上机的。另外，我用FS-SS 得到血小板细胞群 A 而在用CD61-FITC圈门B 而后用CD62p-PE直方图（GATE A and B）得到 CD62p 百分数 和 我用FS-SS 得到血小板细胞群 A 用CD61-CD62P 双参数得到CD62p 百分数（GATE A）不一样呢 ？前者比较高。

niwanmao

1、关于两种方法得到的CD62p和CD61比例不一致的原因，我再补充一句，做血小板还是以不固定的标本为准，因为很多处理措施均可能造成血小板构象的改变，而使其表面标记表达发生变化。从上面的设门图上也很容易看出。建议参考：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... 0%E5%B0%8F%E6%9D%BF
2、关于你说的两种设门方法得到的CD62p比例不一样，我认为跟分母不一样有关。你如果取双阳性，其分母是A；而如果用A AND B的逻辑门分析CD62P的比例，其分母就是A AND B。所以，只要你的CD61、CD62P阳性Marker位置都没变过，我相信，你把分母统一成A，其比例肯定一样。例如第一幅图，假如分母统一成A，那么你利用A AND B分析的CD62P真实比例应该是23.4%*59.5%＝13.923%，跟你用双阳性法分析的比例14.8%相差无几，其中的些许差距可能跟你CD61或CD62P的Marker位置有点小误差所致。

niwanmao

1、两者比例不一致，我认为是跟多聚甲醛固定之后，细胞形态发生改变所致。因为细胞形态发生改变之后，某些细胞离开了原来设的门或某些其它细胞进入了这个门，导致比例改变。
2、一般来说应该是一致的，你注意一下你设的Marker位置是否正确。必要时能否上传一下你的分析图片或原始数据文件上来。大家看看。

水蜻蜓

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       谢谢倪老师，我现在把图附上（手机照相不太清楚）两种方法得到的CD62P也不一样。

水蜻蜓

谢谢倪老师，茅塞顿开。

水蜻蜓

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倪老师您好：

   请问我做了几例血小板活化的标本，CD62P 基本都是10%左右而CD63 则全都小于5%，请问本来有可能是这样？还是CD63抗体有问题呢？CD62P 为什么基本差不多呢？
抗体：CD61-FITC   CD62P-PE   CD63-PE  均为同一家抗体
谢谢啦！

niwanmao

我们这边临床上还没开展这方面的检测，所以也没法给你一个参考值。不过你的数值跟文献还是比较接近的。
见附件： 149881_3794.pdf (123.65 KB, 下载次数: 16)

2010-8-16 20:07 上传

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血小板膜表面 GPⅡ Ⅲ 、 b/ a CD62p 、 CD63 诊断

水蜻蜓

谢谢倪老师，您回复问题的速度很快。以后向您多多学习。