实验遇到棘手的问题，请大家帮我看看

wangshixuan

大家好我在实验室中遇到了一个棘手的问题，想问问大家。我用APC标记了胞内的IL-10，然后看Percp-cy5.5 CD19+B细胞内IL-10比例，其他还选着了PE FITC Pecy7 bv421 APC-cy7标记其他膜标志。单阳IL-10的比例就正常，可全阳关IL-10的比例多达70%多，我的补偿都调的很好，我也用APC和Percp-cy5.5双阳验证，发现也还好。到底哪里出了问题呢？跟破膜有关还是？我把全阳的APC IL-10电压调小，图好像就对了。

niwanmao

如果加了其它Marker，得把整个方案都写出来，看看是否可能是补偿的干扰。因为你把IL-10电压调小，图就对了，那么唯一的可能性就是邻近通道的补偿问题。

wangshixuan

老师，您好，补偿我调的还好，因为补偿是我跟实验平台老师一起调的，应该都调整好了。所以我们也不知道怎么解释。问了bd公司，他们说可能会cy5.5与apc有荧光遗漏，但是我们用双阳管验证了，也还好。

niwanmao

wangshixuan 发表于 2018-6-28 16:43
老师，您好，补偿我调的还好，因为补偿是我跟实验平台老师一起调的，应该都调整好了。所以我们也不知道怎么 ...

补偿调整好了，和补偿是否正确地调整了，概念不同，你们认为的补偿调整好了并不一定就是调整正确了。
IL-10其实是比较好染的一个指标，如果分不出明显的细胞群，已经说明有点问题了。

wangshixuan

我的标记方案：eflour660-IL-10，Percp-cy5.5 -CD19，PE-24，FITC-27， Pecy7-38 ，bv421IgM， APC-cy7-IgD，一上全阳管就出现出现图2的情况，但是胞内的IL-10不太可能那么多，但是单阳管又是对的，实在不知道什么原因。

ghqiu09

niwanmao 发表于 2018-6-28 16:03
如果加了其它Marker，得把整个方案都写出来，看看是否可能是补偿的干扰。因为你把IL-10电压调小，图就对了 ...

倪老师，我最近也经常发现临近通道的补偿会对图形和结果产生比较大的影响，就是有点搞不明白为什么，可以解释一下吗？谢谢

niwanmao

wangshixuan 发表于 2018-6-29 09:46
我的标记方案：eflour660-IL-10，Percp-cy5.5 -CD19，PE-24，FITC-27， Pecy7-38 ，bv421IgM， APC-cy7-IgD ...

你可以做一管FMO对照，就是Percp-cy5.5 -CD19，PE-24，FITC-27， Pecy7-38 ，bv421IgM， APC-cy7-IgD（单单减去IL-10），来看看其它荧光通道对IL-10通道的荧光渗漏，这样就一目了然。

niwanmao

ghqiu09 发表于 2018-6-29 09:52
倪老师，我最近也经常发现临近通道的补偿会对图形和结果产生比较大的影响，就是有点搞不明白为什么，可以 ...

常规流式补偿不可避免，尽量多用FMO对照。

wangshixuan

好的 谢谢您 老师，我现在去弄弄看

wangshixuan

niwanmao 发表于 2018-6-29 14:55
常规流式补偿不可避免，尽量多用FMO对照。

最终验证的结果发现问题出在了APC-cy7这个抗体，它漏向了APC-IL10，导致了假阳性