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悬赏1流星未解决
大家好，最近我的实验需要从小鼠脾脏中提取NK细胞，CFSE标记后回输同种小鼠体内。
做了两次预实验，遇到几个问题希望能有大神来帮忙指点一二
我的步骤：
1、 BD 70微米细胞筛机械研磨制作脾单细胞悬液，预冷DPBS 500g/5min 水平离心机常温离心清洗（细胞房无低温离心机） ，室温15min 裂红，DPBS清洗2次
2、stain buffer 中重悬（5%FBS+1X DPBS），计数，调整至 1X10^7/ml，抗体浓度按照推荐用量计算（NK1.1-PE, CD3e-FITC），加入。冰上避光30min， DPBS洗两次，重悬，调整细胞量至5x10^7/ml上机，选NK1.1+CD3-细胞群（占总淋巴细胞3%左右）
3、 接收管用5%FBS+DPBS包被，在4℃摇床上过夜，上机前倒出大部分液体，留管底液（约0.5ml）
问题：
1、纯度问题：整个分选上机过程持续2h，分选刚开始时回测纯度约为90%，分选结束时回测纯度只有80%左右了，在前向侧向角中看到细胞碎片很多，不知道是否是我接收管里选择的接收液问题？还是分选过程中在室温下，时间过长细胞死亡？还是机子机械性损伤？求解决办法
2、细胞得率：一个脾脏我大约可得单细胞悬液5X10^7个细胞，5个脾脏混在一起分选，第一次做流式分选仪显示收集5x10^5个目标细胞，第二次只有2x10^5个细胞，看到回输实验至少要10^6级细胞，如果要提取这么多细胞是不是磁珠分选更为合适一点？
3、 收集好的细胞要回输回小鼠体内，是不是FBS，BSA等都算是一外源性蛋白，PBS可以直接清洗掉这些蛋白吗？接收液，stain buffer中为保持细胞活性我都加入了FBS，不知道会不会有影响。
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发表于 2018-7-2 13:15:29
，感谢万分！
发表于 2019-7-30 21:05:06