流式胞内染色问题

jiaojiaoliu

倪老师：
    本我刚开始学做流式不久，人外周血PBMC检测Th17细胞，抗体是CD4和IL-17A的。固定剂和破膜剂是ebioscience的kit。做了几次，胞外的CD4染的上，但是胞内的IL-17的荧光信号基本检测不到。请老师帮忙分析下原因。
破膜固定的步骤是按照公司的protocol做的，试剂都是新买的。  破膜剂的颜色是淡茶色的，是不是失效了？(ebioscience公司)
另有个小问题，刺激PBMC的离子霉素和PMA的量较少的话会出现什么情况！  
谢谢！

niwanmao

破膜剂即使失效了也不会导致一点都没有信号。你的CD4和IL-17a是什么荧光标记？有没有可能条件没调节好？
在一定的浓度范围内，IL-17水平应该是跟PMA和离子霉素的量对应增加的。

jiaojiaoliu

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APC-CD4和PE-IL17。胞内的信号检测IL-17+cell通常是0或者0.1%。问了其他实验室做过流式的人倾向于膜没破开。ebioscience公司的protocol是破膜剂加完就可以加抗体的。老师认为还有哪地方可能出错呢？请再指点一下，谢谢！

   

niwanmao

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APC-CD4和PE-IL17。胞内的信号检测IL-17+cell通常是0或者0.1%。问了其他实验室做过流式的人倾向于膜 ...
jiaojiaoliu 发表于 2010-10-21 13:13

                               
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我们检测的时候一般都是破膜剂加入之后孵育5分钟，然后再加胞内抗体，孵育15-20分钟。
你可以一方面改良检测步骤，另一方面同时检测胞内的CD3等标记，验证一下破膜剂是否有问题。
如果破膜剂没问题，就得考虑是否抗体的问题了。

jiaojiaoliu

谢谢倪老师，我再做几个试试看！

gdmcwjx2000

我也是做同样的实验，可以加我QQ交流：16465707

niwanmao

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gdmcwjx2000 发表于 2010-11-8 21:14

                               
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如果大家做同样的实验，在论坛里面一起交流当然更好，不但可以让大家看到交流内容，也可以让其它有经验的朋友提供经验。