细胞凋亡分析的问题，请多指教：）

杜拉拉

老师好！
请问细胞固定液70%乙醇是用蒸馏水还是生理盐水（0.9%NaCl）来配啊？在细胞凋亡分析中，我想用PI染液，实验步骤上说要加鸡红细胞做内参对照，且掺入量为单细胞悬液的10%(请问如何控制为10%).因鸡红细胞需从国外调货周期很长且很贵，请问能自己制备吗？制备方法如何啊？大家都是平时怎么做的啊？刚接触流式细胞仪没多久，请各位大侠多多指教：）l
另外，请问大家在获取数据时圈门吗？（.acq的文件中依次圈门吗？）这样会对后面.analysis的分析模板分析数据时有什么影响吗？感觉有时获取的图像跟后面分析模板分析数据的图像不同呢？一般大家都收集多少个event？

niwanmao

1、70％乙醇当然是用蒸馏水配制。
2、鸡红细胞是在周期检测中作为标准对照的，可以自己配，在河北医科大学学报，2008,29（6）：873中已有报道。

鸡红细胞悬液的配制

3、我不知道你用的是什么机器，我们使用BD的机器，取的时候当然可以设门，只要你不要设置为“只取门内的细胞至？？？个”，就不会影响分析时的数据。

stef1981

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做周期也不一定用鸡红细胞做内参，细胞（处理与未处理）大小、细胞荧光强度都是变化的，用内参也不一定准，还是要靠经验，以上只是个人看法。
做周期获取时可以不设门，分析时肯定要设门，排除细胞碎片、聚集细胞（可以参考相关资料），所以获取跟分析的图形不一样。一般收集门里面10000个细胞。
   

杜拉拉

谢谢二位:)

兔子赵

我上次就是按这个文章配的鸡红细胞，没有问题，不一定要进口的

kitemay

我们也是新做，凋亡时一般用42°热处理使细胞凋亡和高温使细胞坏死作为对照，但是有的癌细胞很不容易凋亡，用的是Annexin V和PI的双染。另外，我想请问一下各位老师，做周期一定要先固定么？同样的样本，用的是BD的机子和试剂盒不固定的情况下比固定的结果好，不知道是为什么。

stef1981

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固定的目的是破膜，才能使PI进入细胞内部与染色体结合
你不固定破膜就能做出来，真不知道你怎么做的

   

niwanmao

我们也是新做，凋亡时一般用42°热处理使细胞凋亡和高温使细胞坏死作为对照，但是有的癌细胞很不容易凋亡， ...
kitemay 发表于 2010-11-17 09:32

                               
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做周期一般用乙醇固定，然后triton x-100等破膜打孔，才能使PI进入胞内，检测到周期。你所谓的不固定检测出来结果比较好，我估计是一些非特异性荧光，并不能反映你培养的细胞真实情况。

kitemay

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我是直接用的BD的试剂盒，他们工程师说可以不用固定

niwanmao

kitemay 发表于 2011-4-25 15:44

                               
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我是直接用的BD的试剂盒，他们工程师说可以不用固定

BD的细胞周期试剂盒是不需要固定的，直接用新鲜细胞即可，不是做广告，我做过几十例，效果挺不错的。