新手请教贴壁细胞凋亡结果分析

绿野LOVE星空

新手请教PI-V双染结果分析问题，贝克曼仪器，按南京建成PI-V凋亡说明书步骤做的贴壁细胞凋亡实验，做了2次预实验，结果都差不多，不知是贴壁细胞消化、射门还是电压原因，看站内其他人FSC-SSC散点图细胞位置都很清晰，感觉我的FSC-SSC散点图中细胞位置都不对，全是凋亡或死细胞

实验处理：空白调电压组，PI组，AnnexinV组，对照及模型双染组，请大神老师帮忙指点分析下，万分感谢！


具体有以下几个问题：
1.这两个单染的结果是否可用；
2.射门及补偿调未调好；
3.散点图太分散，是否是上机细胞中混入了其他杂质或其他什么原因，左下角大比例是否是死细胞.

空白

PI单染

V单染

对照双染

模型双染

niwanmao

效果还不错，只是粘连比较明显，并且样本管挺奇怪的，见下面分析结果：

绿野LOVE星空

niwanmao 发表于 2019-3-3 18:50
效果还不错，只是粘连比较明显，并且样本管挺奇怪的，见下面分析结果：

感谢倪老师的分析，我用的是SHSY5Y贴壁细胞，MPTP诱导模型，0.25%EDTA的胰酶消化5min，1600r/min，5min 离心洗涤细胞。
就分析结果来看，可以断定我最终上机的细胞基本全凋亡或死亡了吧，但消化前看对照组细胞状态良好，排除细胞本身问题，胰酶消化浓度和时间，离心速率合适吗，谢谢！

niwanmao

绿野LOVE星空 发表于 2019-3-6 12:37
感谢倪老师的分析，我用的是SHSY5Y贴壁细胞，MPTP诱导模型，0.25%EDTA的胰酶消化5min，1600r/min，5min  ...

胰酶消化是容易造成Annexin V阳性的，所以对贴壁细胞，AV/PI会很难做。

轩辕河图

从倪老师分析的结果来看，确实是黏连比较严重，而且死细胞（假阳性）过多。有以下建议仅供参考：
1.采用不含EDTA的胰酶消化细胞
2.消化时间不宜过长，清洗可用含血清培养基终止消化，
3.取少量样本进行活细胞计数，避免人为操作造成假阳性
4.含PI染色剂的流式样本，上机检测前必须用300目滤网过滤，即是对仪器负责，也可以减少细胞黏连的影响。