小鼠脾脏CD8T细胞活化后染ifng Gzmb 可以不加刺激剂吗

zzc19941112

我用磁珠分选出小鼠CD8 T细胞，CD3 CD28抗体（5ng/ml）活化3天后固定破膜染ifng tnfa gzmb，发现不加刺激剂也能染出ifng（大约20%）和gzmb（大约80%）。ifng的分群还是蛮明显的。请问这种情况正常吗？这种实验条件下，是否真的不需要加刺激剂呢？
其实我是忘加了.....想试一下能不能染出

niwanmao

不刺激可以有少量，但这么高肯定不正常。

灬MIKI灬Love

你应该是操作protocol的问题，比如有的人BFA（1×））PMA（5ng/nl）+Ionomycin(1ug/ml)刺激4hr；有个别人提前加入BFA，导致胞内因子全部高表达甚至达90%，而且CD8细胞一般分泌Granzyme B比较猛，分泌TNFa 高于IFNr，约高20%，建议刺激时间改为1.5-2hr。

如果有人呼唤

niwanmao 发表于 2019-3-31 19:17
不刺激可以有少量，但这么高肯定不正常。

老师，请问检测CD8+T细胞的granzyme B也需要加刺激吗？还是直接破膜胞内染色即可？因为BD的granzyme B抗体说明书没写要加刺激，但是IFN-γ抗体就写了要加刺激，所以有点疑惑。谢谢老师！

niwanmao

如果有人呼唤 发表于 2022-7-26 20:13
老师，请问检测CD8+T细胞的granzyme B也需要加刺激吗？还是直接破膜胞内染色即可？因为BD的granzyme B抗 ...

不刺激可以测的，就是需要固定破膜。

如果有人呼唤

niwanmao 发表于 2022-7-26 21:57
不刺激可以测的，就是需要固定破膜。

好的，谢谢老师！

jingjingcheng82

灬MIKI灬Love 发表于 2019-7-7 10:18
你应该是操作protocol的问题，比如有的人BFA（1×））PMA（5ng/nl）+Ionomycin(1ug/ml)刺激4hr；有个别人提 ...

有点没明白，提前加入BFA会造成胞内因子全部高表达么？不能同时加入？

niwanmao

jingjingcheng82 发表于 2024-9-9 22:35
有点没明白，提前加入BFA会造成胞内因子全部高表达么？不能同时加入？

理论上说，BFA不会影响Granzyme B的表达，但会影响IFNg和TNFa的表达

至于加入的时机，多数Protocol是PMA+离子霉素刺激4-6小时，再加入BFA 2-4小时，但我印象中也看到有三者同时用的

至于提前加入是否会导致全部高表达，我没试过，目前也没看到相关的文献，估计也没人这么特意去试