测细胞周期用70%乙醇固定的细节？

翟天宇沙坪坝

各位老师请教下，翻了论坛很多帖子，发现用PI测细胞周期用70%乙醇固定时有两种互相矛盾的方法。一种是先用30%的PBS或纯水重悬细胞，再将预冷的纯乙醇逐滴加入重悬液；
第二种是将重悬液逐滴加入预冷的乙醇。
请问两种方法哪种比较正确？另外，细胞固定时是否需要放于摩天轮上旋转（4℃过夜）？

niwanmao

1、建议将细胞悬液滴入70％预冷乙醇比较好。
2、不需要旋转过夜，只需振荡均匀后，放－20度保存。

翟天宇沙坪坝

自己顶一个

翟天宇沙坪坝

niwanmao 发表于 2019-5-5 15:56
1、建议将细胞悬液滴入70％预冷乙醇比较好。
2、不需要旋转过夜，只需振荡均匀后，放－20度保存。 ...

多谢倪老师。还有个问题，细胞重悬用多少量的PBS重悬好呢，滴到70%乙醇后比例不就变了吗？或者PBS重悬后直接滴入无水乙醇使终浓度为70%，比如300ul的重悬液滴入700ul无水乙醇？

niwanmao

翟天宇沙坪坝 发表于 2019-5-6 09:14
多谢倪老师。还有个问题，细胞重悬用多少量的PBS重悬好呢，滴到70%乙醇后比例不就变了吗？或者 ...

不是那么严格，细胞一般用100～200ul PBS重悬，加入到2ml 70％乙醇，浓度变化不大。

楚雪菡

niwanmao 发表于 2019-5-6 16:02
不是那么严格，细胞一般用100～200ul PBS重悬，加入到2ml 70％乙醇，浓度变化不大。 ...

老师，那我们用100uL的PBS重悬之后，逐滴加入300uL的无水乙醇，使终浓度达到75%，这样做会不会对固定有影响？

niwanmao

楚雪菡 发表于 2019-5-9 19:04
老师，那我们用100uL的PBS重悬之后，逐滴加入300uL的无水乙醇，使终浓度达到75%，这样做会不会对固定有影 ...

无水乙醇不好，反而影响结果。

楚雪菡

niwanmao 发表于 2019-5-10 08:55
无水乙醇不好，反而影响结果。

为什么不好？老师能详细说说吗？我们现在感觉在流式前处理上出了问题，结果一直不稳定，希望老师能详细说说这个固定的过程，还有就是固定之后必须放到-20度吗？最多能放几天？