关于CFSE检测淋巴细胞增殖的几点问题

immunology

实验目的是探究LPS对两种小鼠wt，ko的脾脏B淋巴细胞增殖的影响，方法是将脾脏研磨裂红以后染CFSE并用LPS刺激，然后圈门CD19去看CFSE的histogram。现在发现当加了LPS刺激以后，从48h开始就有大量细胞死亡，我怀疑是不是淋巴细胞活化诱导的细胞死亡AICD，现在分析CFSE的话，我怎么在FSC-SSC圈门呢，因为72h细胞在FSC-SSC图上基本都是死细胞了。还是我不圈淋巴细胞群了，直接上来就画CD19的阳性群，然后在CD19中分析CFSE？


做CFSE必须要做在活细胞内圈门吗？
上图：

问题2：分析CFSE的时候是不是收的细胞数越多越好？我发现收1万个细胞和10万个细胞，峰的趋势有差异，好像收的细胞越多，峰的趋势就会被掩盖。

十万

一万

看纵坐标，第一个图收的细胞数是第二个的10倍。
收多少细胞有没有一个建议量？如果收的细胞少了会不会不能反映真实情况？

niwanmao

1、是否加个Live/dead会比较好？
2、细胞数肯定多点好，之所以有这个差异，是否因为获取的时候流速发生了改变？或液流不稳定造成CV大？

immunology

niwanmao 发表于 2019-5-6 19:15
1、是否加个Live/dead会比较好？
2、细胞数肯定多点好，之所以有这个差异，是否因为获取的时候流速发生了改 ...

通过FSC-SSC图应该可以初步判断live/dead了吧？您的意思是这样不是太准？流速始终用一个medium速度收的，流速稳定不稳定怎么看呢，我通过横坐标为time，纵坐标histogram观察了一下，基本是平的。

niwanmao

immunology 发表于 2019-5-6 19:31
通过FSC-SSC图应该可以初步判断live/dead了吧？您的意思是这样不是太准？流速始终用一个medium速度收的， ...

FSC/SSC这个判断不够准，否则咱们就没必要用死活染料了，是吧：）
time参数和FSC组合起来看散点图会更好一点。如果用直方图，你可以分别圈出不同时间段的，看看前面那个CFSE峰的变化

immunology

niwanmao 发表于 2019-5-7 07:45
FSC/SSC这个判断不够准，否则咱们就没必要用死活染料了，是吧：）
time参数和FSC组合起来看散点图会更好 ...

对于判断液流稳定性用time和FSC组合图的原理还是不太懂，FSC在任一时间段应该高低都有吧，因为每群细胞大小不一样，在FSC-time图上怎么看液流稳定性呢？  
另外老师您说的“如果用直方图，你可以分别圈出不同时间段的，看看前面那个CFSE峰的变化“这句话也不太懂。