刺激jurkat细胞检测细胞因子

mandy

@niwanmao 倪老师您好，我用50ng/mL PMA 和 1μg/mL Ionomycin 刺激jurkat细胞，同时加入1μL/mL Golgiplug （BD 555028的固定破膜试剂盒里面的golgiplug，含BFA，用量是按说明书推荐的。）刺激时间是6h，但是检测到的IFNγ-PE只有6%左右？刺激剂之前有用过做其他实验，应该没什么问题。

niwanmao

这个结果像是没染出来，是不是破膜上出了问题？

mandy

niwanmao 发表于 2019-6-13 22:56
这个结果像是没染出来，是不是破膜上出了问题？

我是用BD 的555028这个试剂盒的Fixation/Permeabilization solution处理的，按照说明书，加250μL，固定破膜是一起的，固定破膜后的洗和孵育IFNγ抗体都用这个试剂盒里面的 Perm/wash Buffer，我也不知道是不是这个有问题。

mandy

niwanmao 发表于 2019-6-13 22:56
这个结果像是没染出来，是不是破膜上出了问题？

那倪老师有什么建议我可以调整一下的？

niwanmao

mandy 发表于 2019-6-14 10:02
那倪老师有什么建议我可以调整一下的？

今天才注意到你是刺激jurkat细胞，这样的话没有刺激出来也很正常，因为jurkat是白血病细胞。
你可以先在正常t细胞上测试，如果IFN-g分群良好，就说明刺激体系和染色步骤没有问题，就可以后续在jurkat上面调整方案继续试。

mandy

niwanmao 发表于 2019-6-14 15:50
今天才注意到你是刺激jurkat细胞，这样的话没有刺激出来也很正常，因为jurkat是白血病细胞。
你可以先在 ...

之前就做过一次，从健康人外周血中分离获得的PBMC，也是50ng/mL PMA 和1μg/mL Ionomycin 刺激，同时加入golgiplug，6h后计数，染色上机。

倪老师，为什么作为白血病细胞的jurkat细胞不能刺激出IFN是正常的？我看到挺多文献也是刺激jurkat检测细胞因子的，较多是检测IL-2。

niwanmao

mandy 发表于 2019-6-15 15:32
之前就做过一次，从健康人外周血中分离获得的PBMC，也是50ng/mL PMA 和1μg/mL Ionomycin 刺激，同时加入 ...

我不知道其它文献是怎么样的，分泌细胞因子，从机制上最肯定的，当然是免疫细胞。而偏去刺激肿瘤细胞，是否存在很大不确定性呢？

灬MIKI灬Love

建议尝试PMA浓度梯度（建议PMA更换为5ng/ml），Ionomycin （1ug/ml） +BFA 1×；刺激时间低于2hr

qscdawx

没染过流式 但是检测上清中是有IFNγ的表达的

ZWJ9695

灬MIKI灬Love 发表于 2019-7-7 10:45
建议尝试PMA浓度梯度（建议PMA更换为5ng/ml），Ionomycin （1ug/ml） +BFA 1×；刺激时间低于2hr ...

楼主做出来了吗