萌新第一次做CD4+CD25+FOXP3+调节T细胞，存在很多求助各位老....

逗比猫

新手第一次做CD4+CD25+FOXP3+调节T细胞，抗体用的BD的FITC-CD4，PECY7-CD25，biolegend的PE-FOXP3。
检测BALB/C小鼠外周血的调节T细胞，以剪尾法取100ul全血，之后用SOLARBIO的裂红剂3倍体积冰上裂红15分钟，之后终止裂红，见到液体仍然不澄清，重复用2倍体积裂红一次之后进行细胞表面染色。
破膜试剂盒用的赛默飞的3件套，按照说明书进行，第一次试验破膜1小时，技术员老师说FOXP3没有染上。
第二次实验过夜破膜，第二天早上染FOXP3，结果在附件。技术员老师说FOXP3-PE是弱阳性（或者没染上），然后不愿意给圈细胞。
跪求各位老师指导一下应该如何改进。

niwanmao

破膜三件套是指啥？
foxP3确实没染上，最关键是，为什么CD4不同管之间相差那么大？

逗比猫

niwanmao 发表于 2019-6-27 08:09
破膜三件套是指啥？
foxP3确实没染上，最关键是，为什么CD4不同管之间相差那么大？ ...

谢谢倪老师。
破膜剂用的是这套：eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (Invitrogen™) Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set。里面有eBioscience™ Fixation/Permeabilization Diluent,eBioscience™ Fixation/Permeabilization Concentrate,10X permeabilization buffer。
不同管取的血液量有差距是因为：小鼠剪尾后我取的血从50-200ul都有，怕样本不够，就把50和80ul左右的也测了，所以细胞量有比较大的差距。另外也是想和站友请教下，如何能重复标准的取小鼠的外周血，每次用剪尾法取的血，质量很差，费时费力。下颌静脉丛取血我又老扎不出血，实在是伤脑筋。

逗比猫

有没有可能是FOXP3抗体量不足的情况？
用了BIOLEGEND的1.25ul，昨天翻了几个抗体说明书，0.2mg/ml的抗体很多建议是加5ul以上

niwanmao

逗比猫 发表于 2019-6-27 09:11
谢谢倪老师。
破膜剂用的是这套：eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (Inv ...

不是总细胞量，而是CD4＋T的比例，跟血量无关。
这样看来，你的染色操作上面还是不稳定的。表面染色比例都不稳定，核内foxP3的操作我估计更加够呛，还是一些操作细节吧，没看到你操作，很难说清楚问题会出在哪里。

逗比猫

niwanmao 发表于 2019-6-28 09:09
不是总细胞量，而是CD4＋T的比例，跟血量无关。
这样看来，你的染色操作上面还是不稳定的。表面染色比例 ...

好的，谢谢老师，我还是需要改进技术，多做几次

当你老了

逗比猫 发表于 2019-6-28 10:45
好的，谢谢老师，我还是需要改进技术，多做几次

想问楼主，最后FOXP3染出来了吗？我也是用和你一样的破膜三件套，但是FOXP3检测不出来，现在我不知道是样本问题还是试剂问题了

请叫我黄总

当你老了 发表于 2019-10-14 20:48
想问楼主，最后FOXP3染出来了吗？我也是用和你一样的破膜三件套，但是FOXP3检测不出来，现在我不知道是样 ...

你好，请问你现在做出来Foxp3了吗？我也遇到类似的问题，谢谢。