质谱流式和光谱流式的科普和优缺点介绍，你支持哪个？

niwanmao

流式细胞仪仍然是无与伦比的单细胞分析技术，分析数百万甚至更多细胞上的多个荧光参数的能力，使得流式能够帮助人类深入理解复杂的生物过程。
然而，常规流式在发展过程中，渐渐表现出一些缺陷，主要表现为荧光染料的限制，即使方案经过精心设计，也无法避免光谱渗漏、自发荧光等问题，使用的荧光染料的数量越多，这些问题就越大。


质谱流式
为了克服这个问题，先是出现了质谱流式。
质谱流式的基础原理是飞行时间质谱（TOF-MS），TOF-MS是一种非常精确和稳健的方法，用于测量离子的质荷比。在TOF分析中，所有离子通过已知强度的电场加速，并且测量这些离子在已知距离上到达检测器所花费的时间。 离子越重，到达探测器所需的时间越长。

在质谱流式中，选择的标记是高度纯化的稳定同位素。

为了进行质谱流式检测，需要将同位素引入TOF并且避免细胞污染仪器，这就需要将细胞气化，仅留下同位素，为此，在进行TOF之前，需先将引入电感耦合等离子体（ICP）使细胞气化，将剩余的金属离子引入TOF检测。

所以，通过稳定同位素抗体的标记，经过ICP的细胞气化，最后通过TOF-MS检测离子，三者合一，就是质谱流式。原理绘制成一张图就是下面这样：


质谱流式的优点：
>可以使用传统的标记技术，在方法学上改变很小
>在质谱细胞计数中没有“自发荧光”，因为细胞内部不含镧系元素离子
>无“补偿” 或补偿非常微小
>方案设计更容易

但任何事物都有局限性，质谱流式的缺点：
>与传统的流式细胞仪相比，采集速度更慢，每秒一般最多约1000个事件
>样品制备必须比传统流式更干净，因此在获取时所有生物材料都会气化，如果不干净可能导致碳积聚并降低灵敏度
>商业标记抗体数量有限（不过目前越来越多厂家加入，使得这些目录逐渐在完善）
>复杂的数据结构，需要新的数据分析工具和方法
>由于细胞被气化，所以没法进行FSC和SSC测量


光谱流式
光谱流式是从另一条路解决荧光补偿问题，就是光谱解析，解析原理见下图，需要事先学习荧光素的光谱特征，不同荧光素都有其独特的光谱特征，有点像人脸识别似的，只不过比人脸识别简单多了。通过这种解析，就智能得消除了常规流式累死人的荧光渗漏影响：


但实际上在硬件上，光谱流式同时还大大降低了光路的复杂程度，使得仪器成本能够大大降低。常规流式要做到12色，可能需要12～14个独立检测器和40多个滤光片，而光谱流式，不仅避免了这种复杂架构，而且实现同等参数检测的仪器成本只有常规流式的五分之一。

光谱流式最开始是Purdue大学2004年ISAC会议上提出的，2007年10月9日获得专利US7280204（http://www.cyto.purdue.edu/sites ... 4-issued-patent.pdf），专利后来授权给了索尼，Purdue大学该页面（http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry）还有几个蛮有意思的声明，在此不方便直接翻译，不知道是否有知情人能解答一下？

对于光谱流式，同样也有优点和缺点。
优点是：
>与常规流式在方法学一致，可直接拿来就用，过渡性好
>能通过特异性光谱特征，方便地去除“自发荧光”信号
>即使以前发射波长相近的荧光素，例如GFP和FITC，由于波形不一样，在光谱流式上也能解析开
>方案设计更容易

缺点是：
目前在公开资料中未看到对光谱流式的缺点介绍，但事物都有两面性，我个人虽然未用过光谱流式，但从光谱流式公司公开资料上的光谱流式与常规流式数据对比上看，可以看出在信号强度上，部分荧光素的强度整体是要弱于常规流式的，这可能对于某些微弱信号会有点麻烦，当然，这纯属个人猜测，请用过光谱流式的FLOWER能够出来确认一下。


质谱流式vs光谱流式，你更好看哪项技术？
在本帖底部投个票，通过上面的简单介绍，你觉得质谱流式和光谱流式，哪项技术更有前途？


参考文献：
Introducing CyTOF: Cytometry of the Masses. https://bitesizebio.com/20066/in ... etry-of-the-masses/
John P. Nolan and Danilo Condello. Spectral Flow Cytometry. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3556726/
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.23779
J. Paul Robinson. Spectral flow cytometry—Quo vadimus?http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry

xingzhw

全光谱数据体积太大，对于分析和收集稀有细胞，几百万个细胞数量，对硬件的要求非常非常的大

btx362237729

xingzhw 发表于 2020-3-14 14:59
全光谱数据体积太大，对于分析和收集稀有细胞，几百万个细胞数量，对硬件的要求非常非常的大 ...

体积有多大？

王嘉钰

质谱流式在硬件（尤其是检测器）不出现巨大进步的情况下很难提升上样速度，一般很难超过500细胞每秒且容易堵。几百万细胞的数量往往需要用超过一天的时间收取数据。更容易产生批次效应或样品质量问题。

liuruiluna

因为需要拆分光谱，对光谱的信号的准确度要求得更精细一些。
所以光谱流式对于实验操作、或实验设计是否会对光谱产生影响要求更高，比如固定液、破膜液什么的对表染后的荧光是否有影响、dump channel中混合的不同抗体的光谱信号是否能正确拆分（尤其是如果是串联染料）都要注意。
如果做得指标比较简单、并没有把传统流式的通道都占满了而引起很大补偿的话，传统流式对这些问题的容忍度更高，所以我觉得光谱流式很适合那种--要在一管里做很多靶标，在传统流式上补偿过大也不容易通过配色而优化的实验。

科研废物

liuruiluna 发表于 2022-8-15 15:22
因为需要拆分光谱，对光谱的信号的准确度要求得更精细一些。
所以光谱流式对于实验操作、或实验设计是否会 ...

你好，我想请为一下为什么要特别提示dump channel呢？它在流式的panel配色中扮演了什么角色呢？

niwanmao

科研废物 发表于 2023-5-15 22:18
你好，我想请为一下为什么要特别提示dump channel呢？它在流式的panel配色中扮演了什么角色呢？ ...

dump channel，指的是多个系列特异性抗体混合在一起，用于排除相应系列的细胞。
例如为了做NK细胞，可能会在dump channel中加入相同荧光素的CD3、CD19、CD14等排除掉T、B、单核等等。相同荧光素，可以是串联染料，但由于不同批次的串联染料，在光谱图形上可能会有差异，因此这是大家所担心的，但是如果每个单标都上过了，应该是可以拆分的。

科研废物

niwanmao 发表于 2023-5-16 08:20
dump channel，指的是多个系列特异性抗体混合在一起，用于排除相应系列的细胞。
例如为了做NK细胞，可能 ...

哦哦哦 是这个意思 明白了。谢谢老师

Fusca

没用过质谱流式。光谱流式索尼、Cytek、赛默飞的都用过。感觉光谱流式在多色，特别是15色以上的流式分析和分选上存在比较大的优势。感觉使用下来主要的缺点如下：
1. 不适合经常需要改变panel组成的实验。光谱流式都会推荐完全固定配色中的颜色和抗体，改变的话光谱需要完全重新采集。
2. 单染管消耗巨大。传统补偿采集一个单染管如果有明显阴性阳性分群或者用beads的话采集1000 events就可以做不错的补偿。光谱流式各个机型都设置了强制采集数，一般5000左右。而且beads采集出来的光谱和很多样本的实际光谱不同，故而会推荐用实验组织做单染管，如果组织/细胞比较珍贵的话连单染管都不够。而采集不到足够的细胞数实验无法继续进行。
3.光谱流式实际上是采用最小二乘法为原理来解析光谱的，颜色的强弱不能以荧光强弱论之。例如我们在预实验中就曾经遇到过光谱解析后APC信号消失，而同一样本在传统补偿模式下APC有明显分群的。
4.电压调节不便。光谱流式一般不推荐调节电压，要调节的话一根激光上所有的采集通道电压只能一起调，且需要重新做一遍复杂的补偿，在稀有亚群+弱色的实验中常常需要花费大量时间进行预实验优化。

目前这些问题各个光谱流式厂家也给出了不同的解决方案。例如Cytek Aurora最新软件里就提供了光谱预存（可以容许同一实验中改动1-2个同一颜色的不同抗体，而且一次做好的光谱可以用几个月）以及数据生成后手动对补偿进行少许修改的选项。赛默飞的Bigfoot通过在panel设置步骤给出该机器的复杂性矩阵来预测光谱解析的解析度等。另外数据大小的话我用过的几个厂家都有在导出FCS文件时进行压缩，虽然原始文件确实大，但是FCS现在也不比传统流式下的数据大太多，可以正常的分析。

个人的感觉，光谱流式合适：
1.样本类型固定，检测荧光和通道均固定的实验。
2.颜色超过15种以上，或必须使用重叠度较大荧光的实验。（比如需要测GFP但是某种其他检测抗原只能买到FITC的抗体）。
3.实验样本很珍贵，但未处理对照样本容易取得的（动物实验）。样本特别珍贵的临床型检测也可以考虑，因为虽然测单染步骤需要大量费样本但是一旦panel建立好就可以利用稀少的样本同时检测20-40指标

当然这个新技术还是很推荐大家尝试的。不过一定一定要做好预实验。因为光谱流式有点黑箱的性质，有时根本无法解释为啥某个抗体在某个通道上就消失了（很神奇的是，对调一下两种荧光又会有分群）……总之需要试错，或者就是严格按照发表文献的推荐来选抗体样色。不过可以一次检测完一个组织里的所有细胞类型还是很开心的。

另外，回复一下niwanmao老师，其实光谱流式中的荧光素的强度和常规流式的荧光素强度并不能一概而论的衡量。其实真正弱的是在实验中减去了组织自发荧光和其他通道荧光剩余的比较少，因此荧光素的强度只能在实践中才能知道。另外这个强度和使用的组织类型还有抗体是什么有很大关系。所以并不是说表达弱的抗体就不能放在弱通道上。此外，不知道您看的是哪个机型的厂家数据？因为光谱调电压的问题，其实仪器出厂时的推荐电压都设置的不高，所以示例图上看着也更弱。实际使用时其实传统的弱荧光比如AF700、BV510、PE/Cy5表现都还不错的。

niwanmao

Fusca 发表于 2023-8-16 18:06
没用过质谱流式。光谱流式索尼、Cytek、赛默飞的都用过。感觉光谱流式在多色，特别是15色以上的流式分析和 ...

非常感谢你如此详细的分享。我想将这些内容也分享给公众号的其它站友可以吗？

也非常感谢你的答复，我前面主帖中提到的弱，是指同样的抗体，在平行测试的时候，光谱流式检测得到的信噪比，差于常规荧光流式。4年前没有用过，只看到别人这样的测试结果，所以一直心存疑虑，现在做过一些数据之后，已明白其中原因。