关于CFSE测增殖的问题

cecily · 发表于 2019-7-10 17:44:04

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想请问各位小伙伴，我用CFSE测细胞增殖情况，目前我8ml人的全血大概可以分出1×10^7个/ml PBMC。我现在设置的阳性对照ConA的浓度梯度测增殖情况。分了两组，一组只加ConA，一组加ConA+20U/ml的IL-2。具体步骤如下：

1. 细胞用1ml 0.1%BSA重悬，

2. 加入1 ul CFSE（5mM工作浓度），37℃ 10 min

3. 加入5倍体20% FB终止反应，4℃放置5min；

4. 400g 5min离心（感觉上清液还是有挺多细胞，离心速度能在能快点或者时间再长点吗？）

5. PBS洗2-3次，离心弃上清400g 5min（感觉上清液仍有细胞未完全沉淀）

6. 10% FBS 1640重悬细胞，细胞密度调整为2×106个/ml

7. 细胞铺板到96孔板，每孔加200ul细胞悬液，然后加入刺激

8. 第5天收集细胞到流式管，400g 5min离心（但除了刺激最高浓度的一组，其他感觉管底未见明显沉淀，离心速度还能再快么？还是应该用2ml EP管收集以后最后重悬再转移到流式管呢？）

9. 用PBS洗2次

10.PBS重悬上机

附件是我的细胞照片和流式图片，好像还不是典型的CFSE的那种增殖图片，老师说就是有点那个感觉了，但是还不够典型，如果按我现在的结果，想问哪个浓度的ConA比较好呢？

新手入坑，问题比较多，谢谢大家！

niwanmao · 发表于 2019-7-11 09:15:27

从CFSE增殖看，应该是5mg/ml conA+20U/ml IL-2这管增殖代数最多。

shinian · 发表于 2019-7-11 10:25:13

本帖最后由 shinian 于 2019-7-11 10:28 编辑

flowjo软件有细胞增殖的分析功能

cecily · 发表于 2019-7-11 15:54:27

niwanmao 发表于 2019-7-11 09:15
从CFSE增殖看，应该是5mg/ml conA+20U/ml IL-2这管增殖代数最多。

谢谢老师，但是我们学校帮我上机的老师就说我这个曲线好像不太好，他们觉得看增殖的代数分的不太清楚。

niwanmao · 发表于 2019-7-13 16:42:21

cecily 发表于 2019-7-11 15:54
谢谢老师，但是我们学校帮我上机的老师就说我这个曲线好像不太好，他们觉得看增殖的代数分的不太清楚。 ...

这个增殖峰已经相当不错了，用Modfit软件或者FlowJo软件分析即可。

Cleopatra · 发表于 2019-7-18 11:40:31

印象中人淋巴细胞是PHA刺激吧，动物是ConA，文献中很少看到用ConA刺激增殖呢，但是你的增殖图确实比我做的好看多啦

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