人外周血NK5色

wsyangyin

各位流式老师好，本人研究生一枚，才接触流式有许多问题不是很明白，希望各位老师有空的时候帮忙解答下，谢谢了
1.我做的是5色的流式，标记人外周血PBMCs的NK和一些亚群（如下图）
2.问题1：我的CD56-PE单阳管全部标阳了，但染5色的时候又降下来一些，这是应为CD56单染的时候非特异性结合高了吗？
   问题2：我需要做FC封闭吗？我看群里有的说CD16需要做封闭，但我CD16单阳管分群挺好的，这是为什么呢？
   问题3：我又做了一次CD56单染，与阴性比还是全阳性，然后我将那个单阳管加PBS稀释2倍后有分群的趋势了但阳性还是挺高的？我是否该做个抗体滴定，如果做了滴定还需要FC封闭吗？
   问题4：我是不是不该以单阳管圈门，该以FMO圈门？如果我以FMO圈门需要做Fc封闭吗？

不好意思问题有点多

niwanmao

1、你把所有的散点图都画出来，看一下补偿。
2、你做的这几个标记应该分群都比较好，暂不需要Fc阻断。
3、如果想做标准的话，最好Fc阻断＋FMO

wsyangyin

niwanmao 发表于 2019-7-13 16:29
1、你把所有的散点图都画出来，看一下补偿。
2、你做的这几个标记应该分群都比较好，暂不需要Fc阻断。
3、 ...

CD56  和CD94单阳管都全标阳了，94我不太清楚是怎么样，但56应该阴性多很多才对，老师您看下这个怎么回事呢？是我抗体用量多了吗？麻烦老师了

niwanmao

wsyangyin 发表于 2019-7-14 11:25
CD56  和CD94单阳管都全标阳了，94我不太清楚是怎么样，但56应该阴性多很多才对，老师您看下这个怎么回事 ...

你没理解我的意思，我不要看你的单染管，我是要看你那个加了所有抗体的实验管，所有荧光通道两两组合的散点图。

wsyangyin

niwanmao 发表于 2019-7-14 21:54
你没理解我的意思，我不要看你的单染管，我是要看你那个加了所有抗体的实验管，所有荧光通道两两组合的散 ...

老师这是5色样本两两组合的散点图

niwanmao

wsyangyin 发表于 2019-7-14 22:58
老师这是5色样本两两组合的散点图

由于这款机器免调电压的（虽然有调节电压的选项，但不是真实的电压调节），建议在其它大的机器上再上上看，可能是假像。

wsyangyin

老师，我没太懂您的意思，你是说56全部标阳了这个可能是假相吗？如果换了机器同样的方法可能不会出现全标阳的情况吗？但目前我们实验室只有这一台机子，也没有办法试其它机子

niwanmao

wsyangyin 发表于 2019-7-16 23:57
老师，我没太懂您的意思，你是说56全部标阳了这个可能是假相吗？如果换了机器同样的方法可能不会出现全标阳 ...

想办法借其它机器，因为你仔细观察单标CD56那个样本，CD56其实是分两群的，所以可能整体上漂了。但在多色管，整体下来了。