胞内细胞因子关键问题请教

行棋无悔

各位老师：
       我最近在做胞内细胞因子检测，用20AA的多肽刺激鸡脾脏淋巴细胞，发现阳性率很低，以下是我的大概流程
用病毒感染鸡两次后分离脾脏淋巴细胞，然后用之前ELISPOT鉴定的肽去刺激淋巴细胞，用12孔板培养，每个孔加入350万细胞，阳性对照加入ConA，浓度为10ug/ml，肽段浓度为20ug/ml，刺激2h后加入BD公司的BFA（按1：1000），继续孵育5h，然后收集细胞到EP管进行流式染色。使用BD公司的Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug™进行固定和破膜。由于目前市面上没有直接标记的anti-chicken IFN-y荧光抗体，所有胞内抗体我选用了anti-chicken IFN-y Biotin为一抗，室温孵育1h后加入二抗eBioscience™ Streptavidin FITC ，4度孵育30min，染色后进行流式分析。结果发现阳性细胞很少，我使用一抗的浓度为0.2ug/ml.想请教一下各位老师，针对这个结果我应该从哪些方面进行优化？是否有必要延长孵育时间到16h，是否可以通过加大抗体浓度？谢谢！

niwanmao

你将一抗浓度提高到1～5ug/ml试试，做个梯度。

行棋无悔

niwanmao 发表于 2019-7-18 09:17
你将一抗浓度提高到1～5ug/ml试试，做个梯度。

老师您好！您觉得我做胞内染色刺激时间延长到16h是不是效果更好？还有BD公司的那个BFA阻断12h影响大吗？

niwanmao

行棋无悔 发表于 2019-7-18 10:51
老师您好！您觉得我做胞内染色刺激时间延长到16h是不是效果更好？还有BD公司的那个BFA阻断12h影响大吗？ ...

延长感觉不是有必要呀。免疫细胞反应的时间12小时内应该是能完成的。