请教各位老师怎么解决这个荧光溢漏的问题

yuemin5

做多色染色的时候发现有个抗体表达很怪异，就减掉一些，找原因。现在发现在当前补偿情况下，第4通道（Percp-Cy5.5）的荧光溢漏到了第5通道（PE-Cy7）和第6通道（APC），请问各位老师应该如何调整？
谢谢！

多色方案荧光溢漏

niwanmao

我大概知道你用的机型了。这个光路设计上面，FL4也就是PC5.5得尽量放表达强度偏弱的抗体。
我估计你原来的方案可能是10个通道全满的，所以目前的解决方案：
1、分多管检测。
2、不介意的话，用斜向十字门或不规则门圈目标细胞群。

yuemin5

谢谢倪老师，仪器是Navios三激光十色。我试着调整一下PC5.5的抗体。
另外我觉得我可能没有对这一管做对应的补偿。之前我只用补偿微球做了一个补偿，用到其他管中。估计Tandem染料要每管做补偿。

yuemin5

倪老师，各位flower，我使用本管中的抗体染色补偿微球，针对这一管重新做了补偿，解决了荧光溢漏的问题。确实是偶联染料需要每管单独补偿。
但是现在又发现一个无法理解的现象。在有一管散点图中，发现圈门的细胞比例远高于目测的比例，请问下这是什么导致的？（见附图的下半部分）

重做补偿的效果和散点图问题

niwanmao

yuemin5 发表于 2019-8-14 22:30
倪老师，各位flower，我使用本管中的抗体染色补偿微球，针对这一管重新做了补偿，解决了荧光溢漏的问题。确 ...

这说明补偿并没有解决荧光渗漏的问题，虽然在图形上看着像已经解决了，但比例不对啊。
有时候，可以用不规则十字门分析的，因为有几个通道、有些抗体就是调不到横平竖直的。

yuemin5

估计还是得换一下荧光通道

leiming319

像是FlowJo软件的问题，圈门后显示的比例与实际不符。

yuemin5

leiming319 发表于 2019-8-15 11:21
像是FlowJo软件的问题，圈门后显示的比例与实际不符。

莫非盗版软件有这个bug？

leiming319

有的，碰到过几次

yuemin5

leiming319 发表于 2019-8-21 08:38
有的，碰到过几次

经验之谈，谢谢。我换个软件看看