细胞增殖实验刺激几天后细胞死了很多怎么办？

行棋无悔

各位老师：
      我前两天第二次做CFSE细胞增殖实验，用1uM的CFSE染色细胞，37度孵育10min，然后用RPMI1640+10%FBS洗涤细胞三次后铺板，24孔板每孔每孔一百万个细胞，用PMA和肽段刺激5天，到第四天的时候显微镜下看，染色的细胞感觉都变少了，部分飘起来，像都已经死了的样子。而没有染色的细胞用PMA刺激细胞明显增多了很多。各位老师帮忙分析一下，我应该怎么优化才能把这个实验做好，需要降低CFSE浓度或者染色缓冲液中添加蛋白或者需要在细胞中加入IL-2吗？谢谢各位老师。以下是我的流式图。

niwanmao

CFSE做的梯度，然后孵育时间也做的梯度。但首先要保证细胞状态良好。