染色的顺序

落枫

最近一直在做特异性记忆B细胞，想要用蛋白探针筛选出来。现在我的蛋白探针有带HIS标签和Biotion标签两种。我是先将蛋白与抗HIS的抗体孵育/Streptavidin-PE共孵育后，再和细胞孵育。还是先把探针蛋白和细胞孵育，再染抗HIS的抗体/Streptavidin-PE。另外细胞表面是不是也会有一些这种HIS蛋白，或者生物素类的可以和Streptavidin-PE结合，出现假阳性结果。求各位老师能帮忙解答一下。急，明天要做这个实验。

niwanmao

推荐用Biotin标记的探针先染，染好之后洗涤，再用链霉素PE去染。

落枫

补充一下可能没说清楚，我的蛋白探针，一种蛋白只带一个标签，要不是HIS，要不就是biotion。不是一个蛋白探针带两个标签。

落枫

老师，我发现不加蛋白探针，在细胞里直接加链霉素PE，作为对照，发现有很多假阳性，这种假阳性情况怎么能尽可能减少呢

niwanmao

落枫 发表于 2019-11-4 07:59
老师，我发现不加蛋白探针，在细胞里直接加链霉素PE，作为对照，发现有很多假阳性，这种假阳性情况怎么能尽 ...

这不应该的。Biotin＋链霉素二抗，这种间标方法在以前应用过不少。检查一下一抗和二抗的质量、来源是否可靠，染色步骤是否正确？

落枫

谢谢老师，二抗应该是没问题的，买的BD的。试过很多次了，每次总是会有一小部分细胞会与链霉素的PE或者是抗HIS的PE结合。