10的7次方个细胞 离心之后没有沉淀

zzp

各位大佬，本人最近做流式分选遇到了很大的问题，显示分选出的细胞有很多，离心下来竟然没有肉眼可见的沉淀，希望各位大佬能热心解答，谢谢了

具体问题：所有机器是BD的ARIA分选 ，机器有专门的老师维护和调试 我分的是人外周血PBMC 没有染抗体 根据FSC 和SSC 来分选粒细胞 单核细胞

                分选前细胞有很多，总细胞数在5 ×10^7左右 分出的粒细胞 机器显示有10的7次方 然而10000rpm 离心5min 也看不到肉眼可见沉淀 （机子没有调试好的可能性，基本排除，一是有老师专门调试过 而且在我之前做的人 分出的细胞显示只有几十万个，但是离心下来也有肉眼可见沉淀，我在他后面做并没有调任何参数）
有人说可能是跑完流式的细胞带上了电荷 难以离心 所有我取了20微升上清做细胞计数（总体积1.5ml） 什么都没有看到）另外，和我同样分选人外周血的师姐也碰到了类似的情况但是不知道什么原因，她之前用同一台机器分并没有遇到过这样的情况）
有没有了解的情况的大佬 分析一下 （PS 样品得来不易 做不出实验真的很扎心啊）

家的感觉

1、15ml接收管？总共分选出来多少体积的悬液？如果十毫升以上，离心要适当增加转速
2、仪器显示有10的7次方，分选多久？分选时流速多少？
3、分选过程中仪器显示一切正常吗？分选过程中sort layout窗口显示的实时分选效率大概多少？太低分选效果不好
4、分选完10000吗，这么大转速，还是说是1000？如果15毫升的离心管总体积十几毫升的话，1000离不下来什么
如果直接拿收集的细胞悬液计数（不稀释）还是没有的话，那估计是仪器或操作问题，毕竟不可能分选不到细胞，当然，仪器显示10的7次方，我们收集到计数的细胞不可能达到那么多。
所以我感觉离心的问题占主要原因，再有就是分选时仪器或操作问题（说得有些乱，见谅）

zzp

家的感觉 发表于 2019-11-29 08:47
1、15ml接收管？总共分选出来多少体积的悬液？如果十毫升以上，离心要适当增加转速
2、仪器显示有10的7次方 ...

用的流式接收管就是普通的可以装大概5ml的那种流式管
粒细胞总共分选出来50ml  机器显示是14236691 分选效率 88%
单核细胞分选出来时3ml    机器显示是526610     分选效率 59%
分选速率一般是2 细胞稀的时候会到3 （分选前的细胞每管细胞数不太一致）Thresheld rate 大概在 5000-8000 evt/s （每支管子快跑完的时候大概只能 2000左右）分选时间一共两个半小时把（中间并没有出现堵住的情况）
另外 离心是我把 粒细胞全部集合到了一个50ml管子 单核细胞是两个1.5mlEP管 我第一次离心用的是2000rpm 5min 无明显沉淀 第二次询问了在我前面做分选的人的离心速度就又用10000rpm离了5min 但是仍旧没有沉淀（50ml离心管和1.5mlEP 管都看不见） 然后取了一点点上清 做镜检 什么都看不到  仪器出问题的几率我个人觉得很小 仪器很抢手 每天都有人用然而出问题的只有我和我师姐 （我们两个都分的是外周血，师姐之前分的时候还是很正常的就是最近几次 所以真的很费解

啵啵嘟

分选完直接拿接收管同一台仪器回测，我觉得应该是仪器堵了或者分选参数没有调好，不会是离心不下来的原因。
我遇到过同样的情况，被坑了好多次。
大部分是仪器的原因

家的感觉

zzp 发表于 2019-11-29 15:09
用的流式接收管就是普通的可以装大概5ml的那种流式管
粒细胞总共分选出来50ml  机器显示是14236691 分选 ...

Thresheld rate 大概在 5000-8000 evt/s，感觉挺高的，估计样本浓度也高。看你说的情况，估计还是仪器哪个地方的问题吧，实在不行稍微准备一些细胞，按上次的条件再分选一些，直接回测并拿分选出来的计数（不做任何稀释）看有没有细胞，正常分选出来不可能一点没有的。细胞分选的时间再长也总归会有细胞么

niwanmao

我虽然没做过分选，但是整个看下来，我还是比较倾向于@家的感觉   @啵啵都  站友的看法，问题应该还是出在没分选出细胞，而不是离心。至于为什么分不出细胞，我建议你让熟练的人指导一下，可能是某些设置上的问题。

啵啵嘟

或者我觉得可能是到你分选的时候仪器堵了，你或你上一个人的样品把管子堵了，没有及时清理，就这样了

Jeff

我碰过类似的问题。如果仪器没有问题~~~不知道您离心是用什么管离心的。我建议直接使用水平式离心，1.5或者2mL的EP管倾斜式离心会有很大程度的细胞丢失。之前，我一客户确实碰到过这样类似的问题。确保仪器分选OK的前提下，多考虑下一些微小的因素，也许会改进您的实验结果