GFP荧光细菌与小鼠机体互作之后血液流式分析

ql821770726

问题：使用外源质粒，中间插入GFP荧光蛋白表达序列，将该质粒导入到大肠杆菌中，然后腹腔注射感染实验动物，一段时间之后取小鼠的血液进行实验，实验过程如下，取100ul的血液使用BD的FACS溶血素溶红细胞，300g离心5min，弃上清后加入2ml stain buffer，离心洗涤。目的想检测血液中除了红细胞外的其他免疫细胞对GFP表达的大肠杆菌的吞噬作用，上了流式之后在FITC通道中并没有检测到GFP的表达信号，有没有人做过相关的类似荧光细菌与机体互作的实验，我们不清楚在这个处理过程中如何使细菌的GFP荧光稳定表达，还有，细菌死了之后GFP荧光蛋白还会有颜色吗？

niwanmao

1、细菌注入腹腔之前，有没有先跑过流式，验证GFP的表达？
2、注射小鼠腹腔之后，腹腔内的巨噬细胞吞噬之后，应该再抽取腹腔液体检测才对，为什么采集外周血呢？

ql821770726

niwanmao 发表于 2019-11-30 10:11
1、细菌注入腹腔之前，有没有先跑过流式，验证GFP的表达？
2、注射小鼠腹腔之后，腹腔内的巨噬细胞吞噬之后 ...

感谢老师在百忙之中回答我的问题
1、细菌在注入腹腔之前，都是经过PCR验证的，同时我们还在共聚焦下观察过，细菌的很亮的
2、细菌注入腹腔之后会入血导致败血症或者菌血症，我们想检测动物血液中的免疫细胞对该细菌的吞噬作用，同时确认是哪一种细胞对该细菌的吞噬作用较强

现在我们怀疑在处理组织与细胞的过程中，因为用到了2%多聚甲醛去处理细胞，同时血液的处理用的是BD红细胞裂解液，我们查了之后发现该裂解液中含有15%的多聚甲醛，可能会对GFP的表达以及细菌的活性和状态产生影响，想咨询一下有没有做过相关实验的小伙伴，诚心发问……

niwanmao

ql821770726 发表于 2019-12-2 09:19
感谢老师在百忙之中回答我的问题
1、细菌在注入腹腔之前，都是经过PCR验证的，同时我们还在共聚焦下观察 ...

为什么用多聚甲醛，而不是直接用氯化铵裂解液裂解后上机获取呢？

ql821770726

niwanmao 发表于 2019-12-2 21:39
为什么用多聚甲醛，而不是直接用氯化铵裂解液裂解后上机获取呢？

我们用的是BD的红细胞裂解液，然后我们查看了一下，这个裂解液中是含有多聚甲醛的，之后我查了一部分资料，多聚甲醛是对细菌有影响的。然后我们准备买国产的裂红液试一试，国产的是没有多聚甲醛的