你在用的荧光蛋白在哪个通道检测效果最好？

niwanmao

基因组工程技术的出现，使基因敲入基因表达或融合蛋白报告基因的产生变得更加容易。特定基因的荧光蛋白标记与表面标记分析相结合，可以更特异性地鉴定细胞群。

然而，由于候选蛋白质的数量以及缺乏有关较新的荧光蛋白质的更新的实验数据，使得利用哪种荧光蛋白质来生成报告基因构建体的问题变得困难。使这个问题更加复杂的是，大多数荧光蛋白都是为了显微镜检测而设计和测试性能，在流式上的效果如何，还是缺少测试。

为了解决这个问题，Kleeman等人克隆并表征了13种单体荧光蛋白的检测灵敏度、光谱重叠和spillover，以确定在多色方案中的实用性。13种荧光蛋白的激发、发射光谱特性，以及在流式细胞仪、共聚焦显微镜上的检测通道：



13种荧光蛋白在流式细胞仪各个通道的实际检测效果对比，可以找出激发效率最高的通道：



荧光蛋白单个转染和两个共转染的检测效果：


最后，作者通过综合评估，认为五种荧光蛋白（EGFP、Venus、mTagBFP2、mIFP和TagRFP657）具有高信噪比、最小的光谱重叠和低的Spillover值，适合多色实验。EGFP和Venus二选一，占FITC通道；mTagBFP2单独占一个通道，占PB通道；mIFP和TagRFP657二选一，占APC-cy5.5通道；这三个通道的荧光蛋白标记的报告基因，即使在低水平表达下也可以进行有效的测量，并且可以相互搭配。由于这些蛋白质是单体蛋白质，因此它们可以充当基因表达或融合蛋白报告基因。


图片来源：Kleeman, B., Olsson, A., Newkold, T., Kofron, M., DeLay, M., Hildeman, D. and Grimes, H.L. (2018), A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry, 93: 556-562. doi:10.1002/cyto.a.23360

Veblen

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