关于CD11b测细胞分化的问题

西府海棠121

最近在用CD11b检测白血病细胞系的分化表型。先前用的Biolegend的APC anti-human CD11b（ICRF44）用配套的iso设门后就发现加药过程中CD11b没有分群。由于APC的这个iso假阳性细胞太多，所以换了Biolegend的PE anti-human CD11b（LM2）。同样用PE对应的iso设门，看散点图CD11b似乎没有明显分群，但是等高线图好像又有分群。所以很疑惑，这种情况我到底应该按iso来确定CD11b的比例呢？还是根据等高线图的分群来划门呢？
也就是说，当散点图没有明显分群的时候，通过iso划门和等高线图划门哪一个更准确？


如下图，按iso划门，图2的散点图没有明显分群。但图3的等高线图似乎分为了两群。

iso

CD11b-散点图

CD11b-登高线图

niwanmao

按照密度或等高线。因为你的iso这个设置本就偏右了点。

西府海棠121

niwanmao 发表于 2020-9-1 16:46
按照密度或等高线。因为你的iso这个设置本就偏右了点。

倪老师您好，我有以下两个问题想请教您：
1. 我们实验室现在用的是安捷伦的Novoexpress流式机器，技术给的建议是不改动默认电压（比如APC通道默认600），通过iso直接圈门，拉动坐标轴可以调整细胞群显示范围。而默认电压的情况下，阴性细胞未必在10^3以内。技术说因为BD都是通过调电压把阴性细胞放在10^3以内，所以大家不习惯目前这种新方式，并且说这种做法文章是认可的。虽然细胞比例照理说只和iso划的门有关，和是不是在10^3以内应该没啥关系，但是我还是对此保留疑问？目前流式界接受这种图么？
2. 同上用的安捷伦的机器，APC和PE通道的电压都是默认值。我测U937人单核细胞白血病细胞系的分化，分别用PE和APC的CD11b抗体（各自iso圈门）。用了BD的Fc block（5μL/管 室温15min孵育后直接标抗体）后，发现细胞群整体右移了（例：默认APC电压600，封闭前的细胞标iso，细胞群都在10^3以内；封闭后标同样的iso，细胞群到了10^4左右），整体荧光强度变强。不太理解这是为什么？

问题比较多，谢谢倪老师回答！

niwanmao

西府海棠121 发表于 2020-10-4 11:53
倪老师您好，我有以下两个问题想请教您：
1. 我们实验室现在用的是安捷伦的Novoexpress流式机器，技术给 ...

如果真如此，我觉得还是不要用Fc Block了，原因确实不明，和预期的相反，我也没见到过，你可以与他们技术支持讨论一下看看，或许他们见多识广些。

西府海棠121

niwanmao 发表于 2020-10-4 14:14
如果真如此，我觉得还是不要用Fc Block了，原因确实不明，和预期的相反，我也没见到过，你可以与他们技术 ...

好的，谢谢倪老师！