流式小白请教各位FITC-Annexin V/PI双染检测细胞凋亡

Cheung

检测方法：四正柏FITC-Annexin V/PI双染检测处理方法：所有分组的cells都经过碧云天细胞凋亡诱导试剂盒(TNF-α+SM-164)处理
检测仪器：BD C6（未调节补偿），用的FL1和FL3检测通道
分析软件：FlowJo X

小白刚刚入门，都是摸索着分析，有一些步骤和原理怕是不太了解，所以我会写出来，写得比较啰嗦，还请各位老师不吝赐教，指出错误。感谢！！！

分析流程：
1.用FlowJo调节补偿
（1）FITC 单染 ，FSC/SSC 圈选活细胞（目的是去除细胞碎片），设门选择FL1-A和FL1-H圈选阴性和阳性细胞群（我看有一些帖子用的是FL1+SSC？有什么区别吗）


（2）PI单染同样操作


（3）应用到all samples （不知道为什么阴性细胞群数量很少，而且histogram上看不到）


（4）空白组设定十字门位置

（5）双染组同样圈选活细胞，调用经过补偿的channel【comp-FL1A 和 FL3A】，设十字门划分






请问我上面的操作步骤有什么问题？能不能给一份详细一点的protocol，越具体越好，谢谢大家~
ps 附件是整个操作流程和凋亡诱导的试剂说明书

niwanmao

看分群应该是没问题的。
主要是要做两件事：
1、将坐标显示方式改为Logicle
2、补偿做微调。

Cheung

niwanmao 发表于 2020-11-15 22:16
看分群应该是没问题的。
主要是要做两件事：
1、将坐标显示方式改为Logicle

谢谢倪老师的答复。

老师，再烦请教一下，①我把坐标改成logicle之后，为什么圈选的这一群才是活细胞，是怎么确定的呢？旁边也有一群荧光强度挺强的



②还有MFI这个指数请问是在哪里查看呢，我找了好久都没找着

niwanmao

Cheung 发表于 2020-11-16 15:06
谢谢倪老师的答复。

老师，再烦请教一下，①我把坐标改成logicle之后，为什么圈选的这一群才 ...

哪群是目的细胞，你这里只能通过反设门确定。能够正确表达CD4、CD8、CD3的才算。
MFI，就是Geomean或Median，在图下方的Statistics里面找一下。

xiaogang1

补偿没调好，做凋亡尽量把所有细胞都圈起来，如果只圈活细胞，还怎么分凋亡细胞？

Cheung

xiaogang1 发表于 2020-11-17 09:12
补偿没调好，做凋亡尽量把所有细胞都圈起来，如果只圈活细胞，还怎么分凋亡细胞？ ...

啊不好意思我说错了 应该是去除细胞碎片 那在3楼这样圈是ok的吗

Cheung

niwanmao 发表于 2020-11-16 15:34
哪群是目的细胞，你这里只能通过反设门确定。能够正确表达CD4、CD8、CD3的才算。
MFI，就是Geomean或Medi ...

老师 那我是要全部圈起来吗还是说像3楼这样圈就可以了，旁边那些是细胞碎片吗 我这个不是淋巴细胞来的 只是忘了改过来 是tumor cells