讨论间充质干细胞标志物检测的问题

cellprobe

大家好，我在检测间充质干细胞的标志物，需要建立和 验证方法学。

间充质干细胞的CD73， CD90,，CD105等阳性标志物的表达水平至少都是95-97%以上的；CD34，CD45，CD19，CD11b， HLA-DR

等阴性标志物的表达水平都是在1%以下的。

CD73， CD90，CD105和相对应的同型对照抗体分别用三种不同的荧光染料PC7+ FITC + PC5；

CD34，CD45，CD19，CD11b， HLA-DR等5种阴性标志物都是用同一种荧光染料PE；

每个样本分为两管染色，一管是同型对照组合，另外一管是抗体组合。

抗体使用量：

CD73， CD90，CD105和相对应的同型对照抗体都是按照抗体说明书推荐的使用量。

但是CD34，CD45，CD19，CD11b， HLA-DR的推荐使用量都是20 ul；

所以在同型对照管IgG-PE的使用量是20 ul，CD34，CD45，CD19，CD11b， HLA-DR都减少到4 ul，但是加在一起也是20 ul。

问题1：流式方法建立前必须做抗体浓度滴定吗？

问题2：像CD73， CD90，CD105和相对应的同型对照抗体都是直接按照抗体说明书推荐的使用量，是不是就可以了？抗体使用量不需要再摸索了吧？

问题3：CD34，CD45，CD19，CD11b， HLA-DR都是阴性标志物，它们的抗体使用量从20减少到4微升，需要做验证吗？证明这种阴性不是因为抗体使用量减少造成的？如果要做验证，用PBMC染色，比较每种抗体4 ul和20 ul的染色荧光强度可以吗？

其实我是把几种阴性标志物的表达水平加在一起计算的，如果不超过2%，就算MSC符合标准。

非常感谢！

cellprobe

当初是可以参考BD的试剂盒。

niwanmao

BD这个试剂盒我记得是有证的，对于有证的试剂盒，我建议可完全按照上面的用量、步骤进行操作。不要减量。

cellprobe

niwanmao 发表于 2020-12-31 08:06
BD这个试剂盒我记得是有证的，对于有证的试剂盒，我建议可完全按照上面的用量、步骤进行操作。不要减量。 ...

我们的流式用不了BD的试剂盒，所以只能自己配抗体。倪老师，您看看我上面的问题。谢谢！

范晋波

cellprobe 发表于 2020-12-31 12:59
我们的流式用不了BD的试剂盒，所以只能自己配抗体。倪老师，您看看我上面的问题。谢谢！ ...

1.个人觉得，现在基本没有人做抗体滴定，但是就科研而言，我们会规定细胞量，10的5到10的7为一个T， 一个T 就0.5ug的抗体进行预实验，然后根据表达情况看是否对抗体用量进行调整；

2.预实验按照推荐量加抗体，但是一定要保证自己的样本细胞数能保持在一个相对稳定的范围内，根据与试验调整抗体浓度；

3.抗体抗原特异性结合是流式的基本原理，若说明书推荐量为抗体染色饱和的情况下，随着抗体的逐渐减量，阳性荧光强度会逐渐下降，但是并不会因为减少80%抗体，阳性会突然消失，可以做验证，但是个人觉得没必要。网站里有做抗体滴定的帖子，您可以搜一下看看，希望对您有帮助

wmj123456

范晋波 发表于 2020-12-31 15:11
1.个人觉得，现在基本没有人做抗体滴定，但是就科研而言，我们会规定细胞量，10的5到10的7为一个T， 一个 ...

老师，刚才楼上的同学说样本是PBMC，我想问下，做人的MSC一般选择什么样本合适？是全血还是PBMC？在第一张FSC和SSC设门的时候，是只圈主细胞群就可以了吧？

niwanmao

cellprobe 发表于 2020-12-31 12:59
我们的流式用不了BD的试剂盒，所以只能自己配抗体。倪老师，您看看我上面的问题。谢谢！ ...

我不知道你们为什么说用不了，是不是因为成本的缘故。但为了结果稳定起见，建议用这种经过验证的商品。

1&2、流式方法必须滴定，不滴定虽然能用推荐量，但是未必是最佳。像我们前面站友说的，很多时候不滴定，可能是出于对这个抗体很熟悉，只能说是一种经验的判断。如果你要做标准、做给其它人评判，那滴定就是少不了的一步。
3、阴性抗体同样也需验证，理由同上。

cellprobe

niwanmao 发表于 2021-1-1 10:48
我不知道你们为什么说用不了，是不是因为成本的缘故。但为了结果稳定起见，建议用这种经过验证的商品。

...

我们的设备不能检测APC。

cellprobe

niwanmao 发表于 2021-1-1 10:48
我不知道你们为什么说用不了，是不是因为成本的缘故。但为了结果稳定起见，建议用这种经过验证的商品。

...

倪老师，这种阳性和阴性标志物，怎么做滴定呢？阳性标志物的表达几乎是100%，如果做抗体浓度滴定，没法计算阳性细胞和阴性细胞的MFI；那么对阴性标志物的抗体，又怎么做滴定呢？谢谢。

niwanmao

cellprobe 发表于 2021-1-3 15:38
倪老师，这种阳性和阴性标志物，怎么做滴定呢？阳性标志物的表达几乎是100%，如果做抗体浓度滴定，没法计 ...

与其它样本混合。