血小板圈门疑问

yinxl2017 · 发表于 2021-1-18 23:30:04

倪老师，您好，最近刚学做血小板实验。看了您之前发的帖子，感觉做出来的门和你们的不一样，不知道这样圈门对不对，下面是我的图。有几个疑问：1 我画的那群细胞是血小板吗？2 我是先用FSC/SSC画的R1，然后FITC/SSC选阳性细胞，最后PE/APC统计双阳细胞，这样对吗？ 3 为什么我感觉我的这群血小板细胞这么少啊？我看您站里其他人做的都挺多的啊？4 做血小板实验的时候，我是直接加了相应的药物/ADP + 抗体+全血孵育了20分钟就上机了，没有固定，这样做能行吗？因为我之前用固定和不固定的做了下对比，感觉不固定的结果稍好一些，不过我不敢确定这样对不对，还有不加固定液，是不是不能终止激活，这样对结果是不是也有些影响？5 有关结果分析，我之前也用了同型对照，这个是不是可以省了？还有一个其他的现象是我的单标管不知道为什么没有我上面圈的那群细胞。问题有点多

。可是真不知道去哪问了，麻烦您了老师！

FSC/SSC

CD61FITC/SSC

PE/APC

FITC单标管

niwanmao · 发表于 2021-1-19 08:42:05

PE和APC分别是什么抗体？
同型对照在分群良好的时候，是没必要用的。

yinxl2017 · 发表于 2021-1-19 09:56:05

niwanmao 发表于 2021-1-19 08:42
PE和APC分别是什么抗体？
同型对照在分群良好的时候，是没必要用的。

FITC是：CD41a和CD61, PE是：CD63, APC是：CD62p

niwanmao · 发表于 2021-1-19 11:57:41

这群是血小板，只是建议后续用Area参数来设，会效果更好，例如前两天另一位站友发的：
正常人血小板CD62P表达高
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-8876-1-1.html
(出处: 流式中文网)

其次，这里血小板抗体没有完全染上，说明可能是染色上出了问题，你描述一下你的染色步骤看看。

yinxl2017 · 发表于 2021-1-19 14:40:16

染色过程：1 同型管加355uL HBS(缓冲液)，然后分别加入各同型对照抗体；单标管加入40uL ADP+CD61-FITC/CD63PE/CD62P-APC，HBS补齐到360uL；阴阳性对照及实验组加入抗体cocktail(FITC+PE+APC)270uL+40uL ADP(阳性)/HBS(阴性)/实验组药物，HBS补齐到360uL，2 取血，第一管弃，收集第二管之后的全血，第1步各管加入收集的全血40uL，是终体积到400uL，暗处反应20分钟；3 预冷的1%多聚甲醛4℃暗处固定30分钟，24小时内上机。
倪老师，以上是我的染色步骤；单标管确实出现PE和APC染色没染上的问题，可是三标的实验组和阴阳性对照却染上了。不知道为什么.....还有您说的“建议后续用Area参数来设”是不是上机的时候就设好的？刚开始学做流式，太多不懂的地方，谢谢倪老师.

yinxl2017 · 发表于 2021-1-19 15:24:55

本帖最后由 yinxl2017 于 2021-1-19 15:32 编辑

niwanmao 发表于 2021-1-19 11:57
这群是血小板，只是建议后续用Area参数来设，会效果更好，例如前两天另一位站友发的：
正常人血小板CD62P表 ...

染色过程：1 同型管加355uL HBS(缓冲液)，然后分别加入各同型对照抗体；单标管加入40uL ADP+CD61-FITC/CD63PE/CD62P-APC，HBS补齐到360uL；阴阳性对照及实验组加入抗体cocktail(FITC+PE+APC)270uL+40uL ADP(阳性)/HBS(阴性)/实验组药物，HBS补齐到360uL，2 取血，第一管弃，收集第二管之后的全血，第1步各管加入收集的全血40uL，是终体积到400uL，暗处反应20分钟；3 预冷的1%多聚甲醛4℃暗处固定30分钟，24小时内上机。
倪老师，以上是我的染色步骤；单标管确实出现PE和APC染色没染上的问题，可是三标的实验组和阴阳性对照却染上了。不知道为什么.....还有您说的“建议后续用Area参数来设”是不是上机的时候就设好的？刚开始学做流式，太多不懂的地方，谢谢倪老师.HBS配方：HEPES缓冲液（HBS）：132 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mMMgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, pH 7.4, containing 5 mM glucose，2 g/l bovine serum albumin.

niwanmao · 发表于 2021-1-19 16:33:58

yinxl2017 发表于 2021-1-19 15:24
染色过程：1 同型管加355uL HBS(缓冲液)，然后分别加入各同型对照抗体；单标管加入40uL ADP+CD61-FITC/CD ...

1、2两步里面，不建议用HBS补到360ul。
第2步里面，加入的全血，考虑改为5ul。
最后，如果能够及时上机，第3步省掉，先看看效果。

yinxl2017 · 发表于 2021-1-19 17:37:56

niwanmao 发表于 2021-1-19 16:33
1、2两步里面，不建议用HBS补到360ul。
第2步里面，加入的全血，考虑改为5ul。
最后，如果能够及时上机， ...

那您的意思是流式管中（抗体+ADP/处理的药物+5uL全血），然后孵育，上机前加1mL PBS稀释。是这么理解吧？不过，ADP是按终浓度工作的，我是不是可以把反应体系缩减到50或者100uL，这样抗体和血小板是不是也应该能充分接触？因为如果没有个终体系，ADP浓度不是很好加...

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