小鼠脾细胞刺激后细胞因子表达不高，尤其是IFN-g，求指点

范小亿

各位老师好，我检测的是CD4+的胞内细胞因子，实验中用的5ug/ml的ConA刺激的小鼠脾细胞，阻断剂是1ug/mL的BFA，也尝试过提高BFA浓度，影响不大，刺激时间上尝试过4,6,8小时，表达量也没有很大改善，尤其是IFN-g，基本没有，TNF和IL-2还有部分表达，微调了好多条件，但都做不出来，各位老师求给点意见。
还有，我先前做过ConA刺激后CD69的表达，这个是很明显的，是不是证明我的刺激条件是没问题的？
其次，我看网上说细胞因子的检测，固定破膜很重要，但是IL-2和TNF能检测到部分表达，是不是问题就不在破膜固定那块？

niwanmao

从TNF-α和IL-2的结果看，刺激、固定、破膜应该都是有效果的。
而IFN-γ出不来，是否需考虑刺激时间再延长至24~48小时？

范小亿

niwanmao 发表于 2021-1-26 09:12
从TNF-α和IL-2的结果看，刺激、固定、破膜应该都是有效果的。
而IFN-γ出不来，是否需考虑刺激时间再延长 ...

谢谢倪老师，我尝试过刺激12小时，BFA阻断3小时，没有太大的改善，我再试试更长的刺激时间。
但是结果中TNF和IL-2的表达量是否正常，感觉ConA刺激后都不是特别强，这是正常的吗？

niwanmao

范小亿 发表于 2021-1-26 09:43
谢谢倪老师，我尝试过刺激12小时，BFA阻断3小时，没有太大的改善，我再试试更长的刺激时间。
但是结果中T ...

是挺奇怪的，conA应该对IFN-g蛮有效果的。
另外两个也还行吧

范小亿

niwanmao 发表于 2021-1-26 11:01
是挺奇怪的，conA应该对IFN-g蛮有效果的。
另外两个也还行吧

因为用ConA刺激是用作实验的阳性参照，如果各细胞因子表达量不够高，后续实验则不好开展。我老师执意认为刺激后IL-2的表达会很高，不止我测的这样。

Mgaxw

你可以直接收集上清做Elisa啊，要用流式机器就买一个CBA试剂盒试试

Mgaxw

而且你的刺激时间不足12h，感觉有点短，可以试试24-48h

嚯伊

niwanmao 发表于 2021-1-26 11:01
是挺奇怪的，conA应该对IFN-g蛮有效果的。
另外两个也还行吧

老师您好，后期要做脾单细胞悬液刺激培养，想问一下培养基就是1640+10%血清就可以了吗？

niwanmao

嚯伊 发表于 2022-3-10 11:01
老师您好，后期要做脾单细胞悬液刺激培养，想问一下培养基就是1640+10%血清就可以了吗？ ...

可以的。