细胞周期检测--区分G0期与G1

zys

各位老师好，我要做流式的细胞周期检测，想把G0期和G1期分开来，国内常用的做周期的方法好像只能分出GO/G1、S、G2/M期，不知道各位有没有做这方面的经验。用哪种方法做好？最好能够提供具体点的Protocol。感激涕零。。。
我的流式细胞仪好像是没有紫外光的。

niwanmao

zys 发表于 2011-5-7 11:39

                               
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各位老师好，我要做流式的细胞周期检测，想把G0期和G1期分开来，国内常用的做周期的方法好像只能分出GO/G1 ...

以前看到过一个专利技术，原理很简单，就是利用各期的CYCLIN蛋白表达差异，再结合PI，精确分析各个周期。你可以下载该专利参考参考：http://search.cnpat.com.cn/Search/CNViewSearch?wd=vdkvgwkey=01133652&jsk=search_gb&tempHightstr=chinasipo_toptimes|%CF%B8%B0%FB%D6%DC%C6%DA&ynSearchState=no&wdstr=%CF%B8%B0%FB%D6%DC%C6%DA%20%3CIN%3E%20VFT&px=desc&pxoption=&pageNo=4&MaxPageNo=405

申请号：	01133652	申请日：	2001/11/08
公开日：	2003/05/14	公告日：	2004/09/29
公开号：	1417584	公告号：	1168984
授权日：	2004-9-29	授权公告日：	2004-9-29
专利类别：	发明	国别省市代码：	83[中国|武汉]
代理机构代码：	42104[对照表]	代理人：	胡镇西
发明名称：	双参数细胞周期分析方法
国际分类号：	G01N 33/53;G01N 33/533;G01N 33/577
范畴分类号：	31E16C
发明人：	龚建平;覃吉超;陶德定;冷彦;申漫里;冯永东;高纯;余源
申请人：	华中科技大学同济医学院附属同济医院
申请人地址：	湖北省武汉市汉口解放大道1095号同济医院
邮编：	430030
文摘：
本发明公开了一种双参数细胞周期分析方法，主要解决现有分析方法中不能将细胞周期区分得更为详细的不足。该方法将鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白Ａ单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按１～１６∶１～１６∶８００的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ和Ａ单克隆抗体的混合抗体，利用此混合抗体以及碘化丙啶和核糖核酸酶混合液对所要分析的各种细胞包括肿瘤细胞和正常细胞进行染色，并通过流式细胞仪对其进行荧光检测，从而获得细胞周期蛋白Ｅ＋Ａ表达情况的二维等高图，在图中人们可以清晰地将细胞周期区分为Ｇ＃－［０］期、早Ｇ＃－［１］期、晚Ｇ＃－［１］期、Ｓ期、Ｇ＃－［２］期和Ｍ期六个细胞群体。该方法能减少检测误差，节约样本细胞量，并对肿瘤的研究分析和治疗有很强的指导意义。
主权利要求：
一种双参数细胞周期分析方法，包括以下步骤：１）取经７０～８０％冰乙醇固定至少２小时以上的浓度为２～８×１０↑［５］个／毫升的细胞２～４毫升，离心去除固定液，用磷酸盐缓冲液清洗一遍；２）在步骤１）所得的细胞中加入０．５～１毫升的表面活 性剂，并放置５～１０分钟；３）用２～４毫升磷酸盐缓冲液将步骤２）所得的细胞清洗一遍，再吸干残液；４）配制鼠抗人细胞周期蛋白单克隆混合抗体：将鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白Ａ单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按１～１６∶ １～１６∶８００的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ和Ａ单克隆抗体的混合抗体，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为０．０１克／毫升；５）将步骤３）所得的细胞与０．０５～０．２毫升步骤４）所配制的混合抗体充分 混合均匀，并在温度为２～８℃的条件下放置３０分钟～４８小时；６）用２～４毫升磷酸盐缓冲液将步骤５）中经混合抗体孵育后的细胞清洗一遍，再吸干残液；７）配制异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液：将异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白和 小牛血清白蛋白液按１∶１０～２０的体积比混合，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为０．０１克／毫升；８）将步骤６）中经清洗过的细胞与０．０５～０．２毫升步骤７）所配制的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液充 分混合均匀，并在室温条件下避光放置２０～３０分钟；９）用磷酸盐缓冲液将步骤８）中经荧光素标记的细胞再清洗一遍；１０）配制碘化丙啶和核糖核酸酶混合液：将碘化丙啶与核糖核酸酶同置于磷酸盐缓冲液中稀释，使碘化丙啶的浓度为０．００５～０．１ 毫克／毫升，核糖核酸酶的浓度为０～０．０１毫克／毫升；１１）将步骤９）中经清洗过的细胞与０．５～１毫升步骤１０）所配制的碘化丙啶和核糖核酸酶混合液相混合，室温避光放置２０～３０分钟，用流式细胞仪对其进行检测即可。

zys

很感谢。但这种方法好像国外的文献没见用过。我看国外文献常用Ki67/PI或者pyronin Y/Hoechst 33342双参数法的。但pyronin Y/Hoechst 33342要用紫外波的，我做不了。有那位用过Ki67/PI双参数法的吗？我主要还想用CD34+圈出骨髓的干祖细胞，再分析这群细胞的G0、G1、S期比例。

niwanmao

zys 发表于 2011-5-7 17:29

                               
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很感谢。但这种方法好像国外的文献没见用过。我看国外文献常用Ki67/PI或者pyronin Y/Hoechst 33342双参数法 ...

这几种方法其实都有共性，都是利用G0和G1期之间的蛋白合成或DNA/RNA合成差异，用哪种方法都可以。
但我觉得很多表面抗原要跟PI一起染，都很困难，更不用说Ki67这个核内抗原了。如果有可能，可以尝试用FOXP3的破膜剂，比较稳定。

zys

发错了，本来想传个图片上来的，发现弄上来就很小了，根本看不清

niwanmao

zys 发表于 2011-5-8 22:23

                               
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发错了，本来想传个图片上来的，发现弄上来就很小了，根本看不清

有时候可能看上去比较小，但实际上可以单击图片进行放大查看的。