FITC通道增益调节后出了两个峰是怎么回事？

Lightyear · 发表于 2021-4-19 14:43:50

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本帖最后由 Lightyear 于 2021-4-19 14:46 编辑

仪器是贝克曼CytoFLEX，我想请教下，我测细胞的一个蛋白表达，结合完一抗+荧光二抗，上机检测时候FITC增益是仪器默认值，结果荧光强度特别高超出了仪器范围，所以按照工程师说可以通过调节增益降低荧光强度，于是直接把增益调到了1，荧光强度是下来了，但是奇怪的出了两个峰，请问是什么情况啊？

liuruiluna · 发表于 2021-4-19 16:41:37

可以反向设门看看那个小峰来自于FSC SSC哪个部分

niwanmao · 发表于 2021-4-19 17:58:59

B+2那管是加了什么干预措施吧，看FSC和SSC细胞几乎没了，说明大部分成了碎片，因此那个小峰，应该是碎片。

PS：请下次发帖务必选择技术问答版块（https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?gid=37）下面的子版，不要发在分享版块。这次先帮你转移过去，谢谢配合。

Lightyear · 发表于 2021-4-20 10:15:44

niwanmao 发表于 2021-4-19 17:58
B+2那管是加了什么干预措施吧，看FSC和SSC细胞几乎没了，说明大部分成了碎片，因此那个小峰，应该是碎片。
...

昂昂好的老师，谢谢提醒，下次注意。

另外有个问题是，①我要标记的蛋白应该是在细胞表面表达的，是不是不需要通透处理细胞这个步骤？②另外一抗处理细胞的时候时间过夜，会不会让细胞死亡更多了？③
我的操作步骤是：酶解细胞→离心、清洗3次→通透→山羊血清阻断→一抗孵育4度过夜→二抗孵育2h→清洗后上流式。这个步骤对吗，细胞需要固定吗？

Lightyear · 发表于 2021-4-20 11:12:32

这个峰里是P1门里偏下、居中位置有一小部分。

niwanmao · 发表于 2021-4-20 14:19:28

Lightyear 发表于 2021-4-20 10:15
昂昂好的老师，谢谢提醒，下次注意。

另外有个问题是，①我要标记的蛋白应该是在细胞表面表达的，是不是 ...

1、要标记的蛋白在表面，就不需要破膜。
2、一抗过夜不是个好方法，一般建议30分钟左右孵育差不多。
3、破膜这步去掉，另外一抗孵育不建议过夜。

Lightyear · 发表于 2021-4-21 08:52:47

niwanmao 发表于 2021-4-20 14:19
1、要标记的蛋白在表面，就不需要破膜。
2、一抗过夜不是个好方法，一般建议30分钟左右孵育差不多。
3、 ...

我这个步骤是直接从免疫荧光转过来的，看来是不合适的，那老师固定这个步骤在流式上需要吗？

niwanmao · 发表于 2021-4-21 11:46:11

Lightyear 发表于 2021-4-21 08:52
我这个步骤是直接从免疫荧光转过来的，看来是不合适的，那老师固定这个步骤在流式上需要吗？ ...

表面标记不需要固定。
如果不能及时检测需固定，但是个别标记影响会比较明显，所以如非不得已，不建议。

gc2015 · 发表于 2021-4-21 13:57:11

请问能看一下你的原始数据吗？

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