CFSE标记过程

cym

老师，我用终浓度为1.25uM CFSE标记肿瘤细胞（标记密度为1X10^6)，工作液是用PBS配的，没有加BSA，37°培养箱孵育10min后，加入FBS继续孵育5min，然后用含血清的培养基洗了2次，离心的时候可以看到沉淀为黄色的，但是染色后的细胞重新铺板后，感觉细胞大部分都是碎片了，增殖的很少。请问老师是标记过程中出现什么问题了吗？

niwanmao

1、确保浓度计算准确。
2、CFSE孵育时间减到5分钟。
3、必要时，浓度和时间分别做梯度，找出最佳时间和浓度。
最后，请发帖时，务必选择技术问答版块（https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?gid=37）下的子版，而不是发到分享版块，这次先帮你转移过去，下不为例，谢谢。

cym

好的好的，谢谢老师！第一次发帖有些地方没注意到，以后一定不会了。
1. CFSE我是用的thermo的，18ul DMSO溶解1 trial的粉末制成储存液(5mM)，用的时候取了0.5ul加到500ul PBS中制成工作液（5uM)，然后再加入细胞悬液体积1/3量的工作液，应该是1.25uM了。
2. 第一次做的时候，我试过2.5uM，1.25uM，0.5uM浓度，这次染色过程和我第一次一样，但是得到的细胞沉淀要更黄一点

niwanmao

cym 发表于 2021-5-19 09:06
好的好的，谢谢老师！第一次发帖有些地方没注意到，以后一定不会了。
1. CFSE我是用的thermo的，18ul DMSO ...

上次梯度测试结果如何？

cym

上次染色的细胞镜下看也是几乎没有增殖

niwanmao

cym 发表于 2021-5-19 09:06
好的好的，谢谢老师！第一次发帖有些地方没注意到，以后一定不会了。
1. CFSE我是用的thermo的，18ul DMSO ...

目前整体看下来，步骤没有很大的问题。那么我在想，是不是在实验之前，你先确认一下肿瘤细胞的状态。这是第一块。第二个方法，就是先拿容易做的人外周血淋巴细胞试试。条件没问题，再去试肿瘤细胞。