向各位老师们请教流式测细胞系双染凋亡的几个问题，谢谢

zxt2009

各位老师好，请教一下流式检测凋亡的几个问题，感谢：1. AV-FITC的早凋单染组和PI单染的诱导能否和本实验凋亡模型不一致？

2. 如果单染组可以和模型组不一致，有哪些比较好的凋亡诱导方式能让单染组AV-FITC和PI比较明显呢？（看到论坛有提到用开水烫一下，两个单染组都可以用开水烫一下吗？如果可以，大概需要多长时间呢？因为染色还需要10-15分钟）

3. 检测上样的顺序和目的是否如下：
3.1  无染色空白组（调FSC-A和SSC-A电压，让目的细胞群处于点散图正确位置，如中间偏左，并圈目细胞门P1）
3.2  双染色对照组（调荧光电压，让P1门细胞处于左下角，确定十字门位置）
3.3  AV-FITC单染组（FITC调补偿，让P1门细胞横平）
3.4  PI单染组（PI调补偿，让P1门细胞竖直）
后续就是自己需要检测几个组

4.  关于调补偿，AV-FITC单染组的补偿数据，是否需要继续应用到PI单染组里，然后再调PI单染组的补偿？

5.  关于目的细胞圈门，凋亡的细胞群圈门，是否是根据空白组来先圈？门可以圈大点吗，看到一些帖子说凋亡的圈门需要稍微圈大一点的？

niwanmao

1、可以不一样，目的就是为了调节补偿。
2、诱导可以用阿霉素，喜树碱或依托泊苷等毒性强的药物。不要看那些杂七杂八的小道技巧，还有人说用土呢，难道你真的撒一把土进去吗？咱们做科学实验，还是得讲科学。
3、上样顺序是空白（调电压）、两管单染（调补偿）、双染。其实如果你的实验组，样本分群好，单染其实有时候不一定需要。
4、AV的补偿，不需要应用到PI单染管，你后续只需要把空白、两管单染放在FlowJo或其它商业软件里面，可自动建立补偿矩阵。
5、圈门，空白管不能用，空白管无法反映背景染色，需要根据你实验样本的分群。

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-5-24 17:47
1、可以不一样，目的就是为了调节补偿。
2、诱导可以用阿霉素，喜树碱或依托泊苷等毒性强的药物。不要看那 ...

谢谢老师的详细解答，学习了！

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-5-24 11:38
1、可以不一样，目的就是为了调节补偿。
2、诱导可以用阿霉素，喜树碱或依托泊苷等毒性强的药物。不要看那 ...

老师，我多问一句，延伸3个小问题：
①关于第5点，圈门空白管不能用，那空白管调节FSC-A和SSC-A让细胞群体尽量处于点散图中央后，不需要圈一个门吗？如果不需要空白管圈门，那空白管的意义是否仅仅是作为调节FSC-A和SSC-A的电压的哈？
②真正的实验圈门（P1门和十字门）应该从阴性对照（双染）开始？
③如果实验圈门是从阴性对照才开始，那么是否意味着，前面空白、AV单染、PI单染都可以圈不同的门？？？我感觉自己有点绕进去了。

最后放一个链接，我最初是看的这个帖子来进行双染学习的，这位楼主是用的空白组圈P1门啊？：https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/42193080

niwanmao

zxt2009 发表于 2021-5-25 00:45
老师，我多问一句，延伸3个小问题：
①关于第5点，圈门空白管不能用，那空白管调节FSC-A和SSC-A让细胞群 ...

空白管，仅供新手，确定大概的电压范围，不用于设门。如果你不信，可以试试。
单染调节补偿。如果你对双染调节补偿有自信，当然前面三样都可以不做。

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-5-25 18:06
空白管，仅供新手，确定大概的电压范围，不用于设门。如果你不信，可以试试。
单染调节补偿。如果你对双 ...

好的，谢谢老师的解答，太棒了！我之前也看过别人做，就是空白圈门，然后发现后面的目标群体不对，我也说不上来哪里有问题，现在听您的答案，就解惑了~