检测PBMC中分泌4种细胞因子的多功能细胞遇到的问题

Eugene

有没有小伙伴做过多细胞因子流式呀？自己正在做，遇到了几个问题请教下大家。我做的是PBMC，检测分泌四种细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α和CD107a）的细胞，共8色(还标了死活染料、CD3、CD4和CD8).
1.我刚开始用PMA/ionomycin作为阳性对照，刺激后发现除了CD4内吞外，细胞因子的表达分群也不明显，图1是IFN-γ和CD107a结果，已经算阳性较多了，IL-2和TNF-α表达更弱，和我用特异肽段刺激（图2）的实验组结果也差不多，请问这是什么原因呀，是我抗体用量不对吗（我是按技术支持推荐用量做的，没有滴定)，还是本来就是这样的呀
后来用OKT3刺激（图3），好像IFN-γ和CD107a表达强了点，IL-2和TNF-α还是很弱，而且CD3标记不表达了?（图4），但CD4和CD8表达.

2.圈门时本来是根据某个分群明显的标本来圈的（图5），然后直接copy到其它标本，发现有的标本比较合适，有的不合适（图2），这是为啥呀？

3.我想统计下分泌1、2、3、4种细胞因子的各种细胞所占的百分比，按我现在圈门方法的话（图6），导出的数据有16种细胞，包含了全阴细胞的比例，有什么方法可以将这种细胞排除在外吗？还是必须现在这样导出来，再在Excel自己计算？

niwanmao

1、分群看上去没有问题。至少CD3结合不上，可能因为你用OKT3刺激后，表位被结合了，导致标记不上。
2、刺激后，有必要做FMO，用于帮助设门的。
3、可以导出后，在Excel中计算。

Eugene

niwanmao 发表于 2021-6-18 13:39
1、分群看上去没有问题。至少CD3结合不上，可能因为你用OKT3刺激后，表位被结合了，导致标记不上。
2、刺激 ...

那倪老师，PMA/Ionomycin和OKT3刺激作为阳性对照时，4种细胞因子的表达不会阴阳分群很明显吗？像CD8一样

niwanmao

Eugene 发表于 2021-6-20 16:54
那倪老师，PMA/Ionomycin和OKT3刺激作为阳性对照时，4种细胞因子的表达不会阴阳分群很明显吗？像CD8一样: ...

你这些分群已经很好了

Eugene

niwanmao 发表于 2021-6-21 07:39
你这些分群已经很好了

好滴好滴，谢谢倪老师！

Eugene

niwanmao 发表于 2021-6-21 07:39
你这些分群已经很好了

倪老师，还有两个问题请教下您：
1.胞内因子染色加阻断剂的时间，我看文献中有的是和刺激剂同时加，有的是刺激1h后加阻断剂，是都可以吗？
2.CD107a染色看说明书上是破膜后染，我做了后发现，这样不加刺激的阴性对照CD107a表达也很强，后来看文献里是在刺激细胞时加CD107a抗体，这样做确实阴性对照是不表达的，这是为什么呢？
谢谢！