巨噬细胞BMDM出现两坨不同FSC SSC是因为部分死亡吗

Fzw

亲友们，想问一下如下图的出现两个population有可能是其中一团是死掉的细胞吗？是否应该单独选择右边的团块进行后续分析？自己流式经验不够所以还没见过这个样子的FSC-SSC，之前看到的都是左下角有一些聚集的population所以很好排除掉。--------实验背景信息：小鼠骨髓来源分化的巨噬细胞，负载在自己做的材料上用LPS刺激，因为实验特殊需要是带着材料一起用PFA固定，没有洗涤或者活死染色，之后triton-x破膜然后再把细胞从材料上弄下来，染actin跑流式。同批样品没固定的时候做活死染色是有看到不少细胞死掉，所以想知道这里的流式结果是不是其中一个团块是死细胞？还是说需要额外实验确认这一批用的巨噬细胞分化成功与否？

niwanmao

可以染一个核酸染料（如PI、7-AAD等）或商品化的死活染料（live/dead、Ghost等）。

Fzw

niwanmao 发表于 2021-8-22 10:31
可以染一个核酸染料（如PI、7-AAD等）或商品化的死活染料（live/dead、Ghost等）。 ...

好的倪老师，所以仅凭这个FSC-SSC还不能完全判断是否是死细胞是吗？因为之前担心actin在处理过程中（染活死）发生变化，所以之前的想法是立即把细胞和材料一起固定，之后再消化下来跑流式，特意跳过了染活死这个步骤。如果不染会造成这种问题，可能还是得染一下

niwanmao

Fzw 发表于 2021-8-23 20:54
好的倪老师，所以仅凭这个FSC-SSC还不能完全判断是否是死细胞是吗？因为之前担心actin在处理过程中（染活 ...

如果是事先固定过的，好像是会出现这样分两群的情形，都可以算。

Fzw

niwanmao 发表于 2021-8-24 07:43
如果是事先固定过的，好像是会出现这样分两群的情形，都可以算。

老师的意思是两群都可以圈下来作分析吗？造成这种分群的可能性原因是什么？

wxd

不知道楼主有没有在做这个实验之前检测小鼠骨髓来源细胞的纯度，如果纯度没有问题的话，说明这两群细胞应该都是巨噬细胞。另外楼主也说是检测actin，是细胞骨架的组成部分，说明细胞骨架可能发生了变化，而细胞骨架的变化可能会导致细胞形态发生变化，反映在FSC/SSC坐标系中，确实可能会出现两群细胞。建议楼主检查一下死活染色图片，是否确实有两种形态的细胞。或者流式分析两个细胞群在actin表达方面是否有差异（有差异说明可能是细胞骨架变化引起的，没有差异说明可能是其他因素引起的）。

niwanmao

Fzw 发表于 2021-8-24 20:57
老师的意思是两群都可以圈下来作分析吗？造成这种分群的可能性原因是什么？ ...

我们在临床上，凡是出现这样两群FSC大小不一的同类细胞，一般出现在细胞发生凋亡的时候。

Fzw

wxd 发表于 2021-9-2 17:48
不知道楼主有没有在做这个实验之前检测小鼠骨髓来源细胞的纯度，如果纯度没有问题的话，说明这两群细胞应该 ...

谢谢你的回复！很有帮助！
- 之前检测过几次骨髓分化细胞的纯度，都比较高，所以在之后的批次没有每次都检测，这次出了问题才开始质疑是否是刚开始的分化失败，不过现在来看可能性较低
- 在流式中两个细胞群的actin差异很明显，同样分群（如下图，633-A为actin，可以看到FSC小的群体整体actin也小一些）。由于材料的关系 死活染色中的细胞轮廓比较模糊，暂时还是不能百分百确定死细胞比活细胞形态上小一些。不过综合倪老师的观点应该很有可能是死细胞了，因为直接PFA固定的关系可能细胞整体比较完整，因此比活细胞群体仅仅小了一些。
你的分析逻辑很有道理！谢谢！

Fzw

niwanmao 发表于 2021-9-3 22:09
我们在临床上，凡是出现这样两群FSC大小不一的同类细胞，一般出现在细胞发生凋亡的时候。 ...

好的，谢谢倪老师！