病人PBMC中ＣＤ４分选（阴选）

老鼠人变细胞人

请问大家有没有做过从病人PBMC中分选CD4呢？不知道为什么每次分出来的CD４少得可怜，一个４８孔都铺不满。随后用beads刺激也无法活化，跑流式甚至发现无法染上抗体，感觉是细胞都死掉了。愁死了，也有把不同病人的PBMC混在一起提，但还是很少，且刺激不起来。有没有人有类似的经历以及是怎么解决的呢？谢谢！

niwanmao

分选前的PBMC细胞量如何？
用的是磁珠还是流式分选？

lililil

不同人的PBMC混在一起可能会有一些相互杀的问题存在吧

司徒随风

或者免疫系统已经崩了，可以用正常人的试试。

老鼠人变细胞人

niwanmao 发表于 2021-10-13 11:12
分选前的PBMC细胞量如何？
用的是磁珠还是流式分选？

分选前PBMC一管10的7次方，-80冻过后会有聚团，吹不散。所以量肯定少了很多，因此才会选择不同人的PBMC混在一起分。用的是磁珠分选，阴选法。

老鼠人变细胞人

lililil 发表于 2021-10-14 10:58
不同人的PBMC混在一起可能会有一些相互杀的问题存在吧

理论上这样做应该不可以，但是一个病人只有一管PBMC，觉得最后的量太少了，做不了实验，才会这样做

老鼠人变细胞人

司徒随风 发表于 2021-10-14 15:04
或者免疫系统已经崩了，可以用正常人的试试。

正常人的T细胞分出来状态不错，镜下很亮

niwanmao

老鼠人变细胞人 发表于 2021-10-14 16:54
分选前PBMC一管10的7次方，-80冻过后会有聚团，吹不散。所以量肯定少了很多，因此才会选择不同人的PBMC混 ...

为何不直接分选，而是-80度冻过后分选？ -80度冻存是对细胞活力影响很大的，所以分选不出细胞的原因就在这里。

wxd

因为没有说具体的分选过程，所以不知道楼主分选一次用了多长时间，分选时细胞处于什么样的环境下。我师妹之前分选B细胞的时候，因为贪多，分选耗时太长，并且没有在冰上操作，导致绝大部分细胞死掉了。后来修改了实验方案，将所有操作都在冰上进行，缓冲液、培养基也都是在冰上保存，并且缩短分选时间（从杀老鼠到将细胞放到培养箱）到3个小时之内，效果好了很多。