|
悬赏1流星未解决
您好,最近跑了一次流式,处理成年小鼠的心脏和肝脏,分析细胞周期(倍性分析),大概流程是这样:
1. PBS洗净,留200ul PBS在6cm皿中用眼科剪剪碎,加入15ml管中;
2. 15ml管中加入0.2mg/ml胶原酶IV,DMEM 10ml,37℃ 100rpm水平摇床(管插入37℃水中),摇1h;
3. 800rpm离心5min,去上清,PBS洗一次,离心去上清,加入0.05%胰酶2ml消化1min,再加2ml DMEM+10%FBS终止,离心后去上清;
4. 2ml PBS洗一次,800rpm离心5min,去上清;
5. 2ml ACK洗1次,800rpm离心5min,去上清;
6. 2ml PBS洗一次,过滤网,收集在1.5ml管;
7. 小离心机4℃ 400g(2200rpm)离心5min,留50ul,吹散后缓缓滴入500ul冰75%乙醇,4℃旋转过夜;
8. 400g 4℃离心5min,去上清,1ml PBS洗一次,去上清,留50ul,加Rnase和PI染色(试剂盒),跑流式。
发现利用FSC-A,SSC-A过滤后细胞都在左下角,可能是凋亡细胞;
接着用SSC-H,SSC-A去黏连,发现找不到黏连细胞:
最后分析发现可能都是凋亡细胞。
大约总细胞量跑了5万个,请问问题是出在处理样品的哪一步骤呀?
|
|