流式分析细胞系阳性率过程中遇到的问题。

小怪兽de爸爸

各位老师好，
      最近构建了一株带有GFP荧光的细胞系，显微镜下观察GFP荧光细胞比例接近100%，但使用目的蛋白抗体做IFA结果显示阳性细胞仅占10%左右，故使用流式进行细胞阳性率分析。
      标记细胞的抗体为PE直标靶蛋白抗体（说明书表示可用于流式），仅打开流式细胞仪的PE通道进行检测，结果如下图，请问为何没有标记的阴性细胞系的荧光强度比过表达目的蛋白，且使用抗体进行标记的还要强呢？

小怪兽de爸爸

为何上面没有图片呢？补充在这里了。

niwanmao

从描述上看，这个实验存在不少变数：
1、各株GFP强度是否存在差异？不染抗体，直接检测可比对，因为GFP可影响PE通道的检测。
2、该抗体是否能确定用于流式检测靶蛋白？效果如何？未事先验证。尽管说明书说可用，但还是需要有阴性对照、阳性对照，分别验证其灵敏度和特异性，然后才能再用于此实验。

只有这样确认过之后，这个实验才能正确解释结果。

目前你怀疑的点，我个人认为可能是细胞株之间的GFP强度不同导致渗漏到PE通道荧光量不同导致意外差异，但该抗体，可能根本就没染上去。

scaleus

应该是GFP渗漏到PE导致的，你可以不染PE然后打开GFP和PE看一下

小怪兽de爸爸

niwanmao 发表于 2022-2-6 10:14
从描述上看，这个实验存在不少变数：
1、各株GFP强度是否存在差异？不染抗体，直接检测可比对，因为GFP可影 ...

谢谢您的解答，
1、各细胞株的GFP强度的确存在差异，对照细胞的GFP强度远高于样品组。
2、该抗体仅在说明书中描述可用于流式检测，未事先验证。

小怪兽de爸爸

scaleus 发表于 2022-2-6 12:22
应该是GFP渗漏到PE导致的，你可以不染PE然后打开GFP和PE看一下

这样做的时候FITC通道基本在10^4左右，PE通道值在10^2左右。

niwanmao

小怪兽de爸爸 发表于 2022-2-6 21:33
谢谢您的解答，
1、各细胞株的GFP强度的确存在差异，对照细胞的GFP强度远高于样品组。
2、该抗体 ...

那么这个就对了，GFP荧光渗漏到PE通道，导致的PE异常增高。