BrdU和PI双染结果分析

Jeffery_9

FITC-BrdU和PI双染上机，对照组有单染PI、单染BrdU、未进行BrdU处理加入BrdU抗体和PI
实验组有对照组和两个处理组
直接用原始数据分析，FITC有两个峰，但是感觉补偿不太对；补偿调整后（如下图）横平竖直，FITC只有一个峰了，不知道哪种情况是对的
FITC和PE补偿应该怎么调



圈门应该是以未进行BrdU处理加BrdU抗体作为阴性对照来圈吗，还是按照别的对照呢？
原始数据我上传在下面。（Blank指未进行BrdU处理但双染）
求大神帮忙解答！！！

Jeffery_9

不知道图片为什么没发出来

niwanmao

Jeffery_9 发表于 2022-4-3 17:14
不知道图片为什么没发出来

图片未显示出来是因为你上传图片的方式不对，需要通过“高级模式”编辑器工具栏上的上传图片按钮上传。你是不是直接拖到框里面了？

至于分析，可用Blank管设置，但是似乎实验管都没跑出明显的BrdU+群体，是不是试剂或处理中出了啥问题？

Jeffery_9

niwanmao 发表于 2022-4-4 10:08
图片未显示出来是因为你上传图片的方式不对，需要通过“高级模式”编辑器工具栏上的上传图片按钮上传。你 ...

现在看图片又出来了
用Blank管设置的意思是未用BrdU处理，但有抗体的这一管就是圈门的阴性对照吗？
补偿调的我不知道对不对，都没有明显的阳性群是说和Blank比变化很小是吗，但是单染BrdU确实有两群细胞啊
我是收细胞前加BrdU孵育一小时，固定完之后加DNase孵育了一小时染色（按照BD的BrdU Flow Kits的protocol做的，应该没问题吧）

niwanmao

Jeffery_9 发表于 2022-4-4 15:00
现在看图片又出来了
用Blank管设置的意思是未用BrdU处理，但有抗体的这一管就是圈门的阴性对照吗？
补偿 ...

图片是我帮你另存为，然后重新上传的


是需要用未加BrdU但加了抗体的这管，因为这个可反映出抗体的非特异性结合。

补偿可微调，使其放平，但是双染确实没分群出来，单染和双染的操作是一样的？仔细回忆一下是否存在什么细节上的差异？

Jeffery_9

niwanmao 发表于 2022-4-4 15:03
图片是我帮你另存为，然后重新上传的

谢谢倪老师
那这个blank管加了PI也没影响吧
上面那张补偿调节图里面算是放平了吗，
操作应该是一样的，因为是染色前从其他孔里面吸出来一点细胞做的单染管

niwanmao

Jeffery_9 发表于 2022-4-4 15:31
谢谢倪老师
那这个blank管加了PI也没影响吧
上面那张补偿调节图里面算是放平了吗，

加了PI才好拿来做参照的。这其实相当于多色流式的FMO似的。

可多试几次看看，尤其是各步的孵育时间延长看看。科研实验经常这样，很多时候不会一次成功的。

Jeffery_9

niwanmao 发表于 2022-4-4 15:59
加了PI才好拿来做参照的。这其实相当于多色流式的FMO似的。

可多试几次看看，尤其是各步的孵育时间延长 ...

好的，多谢老师
我下次准备试试APC-BrdU的抗体，请问我需要设置什么别的对照管吗

niwanmao

Jeffery_9 发表于 2022-4-4 16:04
好的，多谢老师
我下次准备试试APC-BrdU的抗体，请问我需要设置什么别的对照管吗 ...

暂不需要。