请教一下，在跑流式的时候仪器会自动选择激光的吗？

chenjincheng

倪老师以及各位老师，我们平时在用流式细胞仪的时候一般都是把仪器的激光都打开，然后在软件里选择要用的荧光，比如FITC和PE等，但是我们知道，有些荧光染料，比如PE，既可以被488激光激发，也可以被561激光激发，如果我们的仪器同时开启488和561激光，那么我们最终收集到的PE信号是来自488还是561的？还是是两个信号的总和？这涉及到补偿调节的问题，如果用488激光，那么FITC和PE会有大量的重叠，而如果用488激发FITC，用561激发PE，则两个荧光基本没有重叠

Climber

我猜您想问的是为什么同一种荧光素选择不同的激发光会带来不同补偿的原因吧，原因就在于不仅仅需要考虑激光，同时还需要考虑对应的通道问题，在光路系统中大多数仪器是根据激光来进行分类的，比如说FITC一般为BL1，如果PE用488激发的话就是BL2，蓝激光打在细胞上后会被对应一根光纤将光信号转移至到光路系统进行通过滤光片来进行不同波长光的拆分成不同通道。而PE如果用561激发的时候，此时被黄激光打在细胞上后会进入转移到另一个光纤然后进行不同波长光的拆分，所以对于488和561激发PE的区别就在于进入的收集光信号的光纤不是同一个。FITC走的是蓝激光的光纤，当488激发PE的时候也是走的蓝激光光纤，所以就会有补偿问题。当用561的时候就是走的黄激光的光纤，此时与488激发的时候完全不是一个光纤传播光信号，所以就不会有补偿问题 如图所示（图中虽然没有561）。
但是我们实际工作中在不同激光的通道间也会有补偿问题，原因在于滤光片的搭配选择以及荧光素的本身特性，比如PE在488或561被激活，但是并不意味这种荧光素只会被488 561激光，在其他激光照射下可能也有一点荧光表达，同时还跟滤光片的搭配有关。
个人愚见，仅供参考。

scaleus

要看你的滤光片配置

niwanmao

用哪个波长激发，通过哪个滤光片接收，都是跟仪器的硬件光路设计有关，这也是仪器质量不同的一个重要因素。

bslhk

有的机器有这个选项，不用的激光可以关闭。不过一般没人用这个功能。还有两个以上的激光不是一同照射的，是一个先一个后，根据正确的延迟来吧信号整合到一个细胞上。举个例子就是两个激光488和561激光，他们的延迟是N，也就是说你细胞在被488照射后N秒后这个细胞会被561照射。发射光是走不同的路径的，488的走488下的滤光片，561走561的滤光片不会混合。

闷油瓶

Climber 发表于 2022-4-27 13:02
我猜您想问的是为什么同一种荧光素选择不同的激发光会带来不同补偿的原因吧，原因就在于不仅仅需要考虑激光 ...

所以楼主提的这个问题我感觉是无法避免的，PE被488激光照射时产生荧光1，被561照射时产生荧光2，荧光1和荧光2估计都会被机子接收，虽然走的不是同一个收集通道，但是荧光1确实会对FITC通道的荧光有影响（理论上的，这个其实可以忽略，但是在举例子）这个影响的补偿必须得调， 调的参照必须是荧光1，但是机子没有办法区分荧光1具体是多少，所以我感觉解决办法就是通过选用不同的组合，避免这种情况的发生。

Climber

闷油瓶 发表于 2022-4-28 16:18
所以楼主提的这个问题我感觉是无法避免的，PE被488激光照射时产生荧光1，被561照射时产生荧光2，荧光1和 ...

是的 因为细胞会通过所有的激光照射点 所以无法避免

Climber

闷油瓶 发表于 2022-4-28 16:18
所以楼主提的这个问题我感觉是无法避免的，PE被488激光照射时产生荧光1，被561照射时产生荧光2，荧光1和 ...

但是区别就在于PE走561时 FITC对其不影响 但是BL2实际上受到了FITC的影响，但是我们此时并不分析BL2的通道

闷油瓶

Climber 发表于 2022-4-28 18:22
但是区别就在于PE走561时 FITC对其不影响 但是BL2实际上受到了FITC的影响，但是我们此时并不分析BL2的通 ...

机子在处理信号的时候，BL2的信号和PE走561时候的信号，两个信号没有整合到一起？是分着的？如果是分着的，那倒简单了