免疫重建后不同时间检测T和NK比例，和前次试验结果有出入

卷卷儿梨

求助各位老师：人的PBMC回输到免疫缺陷的小鼠体内，我们之前做了一次试验，分别在D7、D10、D14检测小鼠外周血中人CD45、CD8、CD56、CD16的比例，CD45比例逐渐升高，后面我们又重复了一次，在D7、D12检测CD45比例，但是这次我做完以后发现CD45并没有升高，如下图。我是个小白，没接触过流式，所以流式操作以及设门方式都是请教别人做的，但他们也不是很懂，所以想问问各位老师，我这个是什么情况呢？哪里需要改正？流式操作如下：

（1）外周血样品处理
1）将约100 μL小鼠抗凝血样转移到流式管中，加入1 mL 红细胞裂解液，涡旋5秒后室温裂红；
2）10分钟后，350g/5min离心，弃上清液；
3）加入1 mL红细胞裂解液，轻缓吹打均匀，室温放置；
4）5分钟后，350g/5 min离心，弃上清液；
5）加入1 mL 无菌D - PBS重悬细胞；
6）300g/5min离心，弃上清液；
（2）流式抗体染色
每50 μL样品中加入：2 μL hCD45+、2 μL hCD8+、2 μL hCD56+、2 μL hCD16+，4℃孵育15min后，加入1 mL无菌D - PBS，350g/5min离心，弃上清；用300 μL无菌D - PBS重悬样品，转移到流式管中上机进行流式检测。

niwanmao

将淋巴门去掉直接圈CD45+的话，结果是否一致？

卷卷儿梨

niwanmao 发表于 2022-4-29 18:17
将淋巴门去掉直接圈CD45+的话，结果是否一致？

我们这边试了一下，细胞数 在D12还是比D7少的多，D20的数据来看，有小部分小鼠CD45比例是在升高的，有很大部分小鼠CD45比例是没有变化，所以我现在是怀疑有部分没重建起来，不知道老师您看我的操作这块有没有问题

niwanmao

卷卷儿梨 发表于 2022-5-1 19:54
我们这边试了一下，细胞数 在D12还是比D7少的多，D20的数据来看，有小部分小鼠CD45比例是在升高的，有很 ...

操作看不出明显大问题。可能是没有重建好。

卷卷儿梨

我们又询问了做免疫重建很有经验的老师，确实是会出现这种现象的，谢谢老师的耐心解答~

不停

想问下楼主，用的是什么品种的免疫缺陷小鼠呀？

卷卷儿梨

不停 发表于 2022-5-11 12:54
想问下楼主，用的是什么品种的免疫缺陷小鼠呀？

百奥的B-NDG B2m KO plus mice，不过用已经筛好的Donor回输后体重下降很多，我们也试了集萃的NCG B2m KO小鼠，体重要好很多，供参考

tiger

卷卷儿梨 发表于 2022-5-16 13:31
百奥的B-NDG B2m KO plus mice，不过用已经筛好的Donor回输后体重下降很多，我们也试了集萃的NCG B2m KO ...

体重下降说明发生了GVHD。在圈定hCD45时，加一个同荧光的mCD45，门控所有WBC，再加一个不同荧光的hCD45，双阳性为hCD45，这样不会漏检细胞，还有先标记后裂解，过程简单，少丢细胞。

卷卷儿梨

tiger 发表于 2022-5-23 12:50
体重下降说明发生了GVHD。在圈定hCD45时，加一个同荧光的mCD45，门控所有WBC，再加一个不同荧光的hCD45， ...

我们购买的Donor是公司已经筛选过的GVHD反应小的，不过品系是NCG，用百奥的B-NDG B2m KO plus mice进行免疫重建后，体重持续下降，小鼠从20g左右降到12g，没有死亡。同时没有任何操作的同品系小鼠体重一直维持在18g到22g，从外部表现来看，是GVHD反应，但是解剖后，主要脏器没有异常（肝肺肾），脾脏没有肥大，没有做病理，所以关于GVHD反应我们也很困惑。
关于流式的操作，我们会试一下您说的这个方法。
同时我们还了解到，血样里的细胞比较脆弱，其他老师建议我们标记死活细胞，做一个区分