巨噬细胞流式分型

limao

本人在做诱导巨噬细胞RAW向M1型的造模，用LPS诱导后通过流式检测CD80的表达（FITC单染）。刚接触流式，有几个问题想请教一下。


1.增益问题。
仪器为贝克曼cytoflex, 培训时仪器负责老师说增益要调到20以上，阴性细胞群调到10^2到10^3之间，结果会比较准确。但是我的巨噬细胞blank组（没有加抗体和任何处理）在增益是1的时候他的荧光强度就已经在10^2到10^3之间了，甚至超出了10^3，这个时候我应该调增益到多少呢?是1还是20以上呢？没有加抗体也有这么强的信号是正常的吗？
2. 圈门问题
我的细胞是纯的RAW，是应该圈一个细胞集中的区域还是分析所有的细胞呢？FSC-SSC图感觉可以分为三个群，这个细胞细胞体积很小，是应该圈P1和P2吗？但是细胞极化后体积会不会变大，然后变到P3门里呢？而且随着细胞体积变大他的荧光信号也会变强，可是我没有加荧光抗体呀
3. 巨噬细胞极化问题
用LPS刺激后与对照组比荧光强度没有任何变化，不知道是不是要与IFN-γ联用呢？染色步骤为PBS洗涤后用BSA封闭半小时，1毫升一抗（1:800稀释）孵育30min-1h,PBS 洗涤后1毫升二抗（1:800）孵育30min-1h,洗涤后上机检测，这个时间跨度会造成细胞大量死亡吗？有做这方面的同学也请不吝赐教，谢谢！

niwanmao

1、增益没有硬性要求，仪器负责人的说法，主要是针对他平时测的细胞，并且主要是指荧光参数，而你这里关注的是FSC和SSC，这个参数并不要求必须在20以上，而是根据细胞大小而定。
2、圈门，建议P2+P3。
3、你用的是不是流式抗体？此外，从来没见过用1ml的染色体积，所以问题出在你的染色上面。

limao

niwanmao 发表于 2022-5-5 19:45
1、增益没有硬性要求，仪器负责人的说法，主要是针对他平时测的细胞，并且主要是指荧光参数，而你这里关注 ...

谢谢倪老师！说明书上写的可以用于流式，免疫荧光，WB等检测，推荐稀释比例是1:200-1:1000，我就取了1微升的抗体加到了1毫升的PBS里，重悬细胞4度孵育半小时，请问是体积太多了吗？

niwanmao

limao 发表于 2022-5-6 14:08
谢谢倪老师！说明书上写的可以用于流式，免疫荧光，WB等检测，推荐稀释比例是1:200-1:1000，我就取了1微 ...

体积太大了，这上面说的稀释比例，大多是针对Western blot的。你得尽量按照1:200甚至更高的浓度来做，5~20ul，做一个梯度滴定，确认最佳浓度，染色总体积保持在100ul。

limao

niwanmao 发表于 2022-5-6 18:26
体积太大了，这上面说的稀释比例，大多是针对Western blot的。你得尽量按照1:200甚至更高的浓度来做，5~2 ...

好的，谢谢老师解答