流式单染Alexa Fluro 488相关问题

LauChiuwing

各位老师好，我是流式新手，刚做了两三次，遇到一些问题，希望老师们能不吝赐教。
1、我的实验是验证细胞膜上的一个抗原，用的是间接标记法。由于没有Alexa Fluro 488通道，选择的是FITC。请问单染做散点图时，横轴是FITC，纵轴应该是什么呢？我看有的小伙伴纵坐标是FL2-H，是另外设一个荧光通道吗，还是FSC/SSC呢？如果是FSC/SSC需不需要取log？
2、圈门时FSC-A SSC-A的图一定不能取log吗？
3、圈目标细胞要圈到百分之多少是理想的呢？
4、细胞不固定能放多久？
5、左下角没有细胞是没有碎片吗，FSC的value是用来去除碎片的吗？
6、推荐用什么软件处理流式数据呢？

sunny2829

LauChiuwing 发表于 2022-6-17 17:03
谢谢老师的回答，还想请问一下，如果以FITC为横轴，SSC-A为纵轴，这里的SSC-A也是不用取log，只有横轴FIT ...

是的，FITC为横轴log，SSC-A为纵轴lin

sunny2829

1、Alexa Fluor48和FITC，仪器的检测通道都是一致的，FL1通道，或者说FITC通道。单染的散点图，横轴FITC，轴可以选择SSC或者其他任何一个荧光通道。FL2，根据仪器确定，是另外一个荧光通道，一般是PE。
   
2、圈门时FSC-A SSC-A的图，FSC/SSC，是通过前向角和侧向角，用来选择目的细胞群的，细胞一般都是Lin线性模式。检测微小颗粒，血小板等才会用到Log对数模式。

3.圈目标细胞要圈到多少，这个无法明确的额。一般是通过电压调节，圈选目的细胞群，尽量排除碎片和死细胞。

4、细胞不固定的话，需尽快检测，4℃避光1-2h还是可以的。过夜估计就不行了。

5、Calilbur仪器是吗？FSC的value增加，可以减少碎片。一般左下角都会有碎片，如果没有，可以尝试调节电压， 看下是否碎片和细胞群没有分开。或者FSC的value这里，已经选择去除了。

6、推荐FlowJo软件

niwanmao

补充第6点，我们网站首页的几款免费软件也是不错的。

LauChiuwing

sunny2829 发表于 2022-6-17 09:51
1、Alexa Fluor48和FITC，仪器的检测通道都是一致的，FL1通道，或者说FITC通道。单染的散点图，横轴FITC， ...

谢谢老师的回答，还想请问一下，如果以FITC为横轴，SSC-A为纵轴，这里的SSC-A也是不用取log，只有横轴FITC取log吗